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(五) 酶促反应影响因素及反应条件的选择
• 影响酶促反应的因素主要有底物浓度、酶浓度、温度、pH、 •
• • •
抑制剂、辅因子和激活剂等 1.底物浓度 当底物浓度[S]>>Km，米-曼氏方程中的Km 可以忽略不计，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，反 应速度与酶浓度成正比。根据米-曼氏方程，一般酶活性测 定时底物浓度最好为Km的10~20倍，初速度可达最大速 度的90%~95%。 2.酶浓度 按照中间产物学说，只有[S]>[E]时，酶才能被 底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。 3.温度 多数酶的最适温度在37~40℃，高于或低于最适温 度，酶活性都降低。 4.pH pH过高或过低均可导致酶活性下降。一般来说，血 清中大多数酶最适pH在6.5～8.0之间。
从酶促反应时间进程曲线可以看出，酶促反应的各期具有以下 特点：
• 1.延滞期 对单一酶促反应而言，在过量的底物存在下，底
物与酶结合启动酶促反应。
• 2.线性期 指酶促反应速度达到并保持恒定速度进行反应的
时期。此时，反应速度不受底物浓度的影响，又称零级反 应期。此期酶活性与酶促反应速度成正比。
• 3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，
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(三)Vmax的应用
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定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。 应用：
Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：
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3、酶活性单位的计算
步骤：
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明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位 定义确定物质量、体积和时间的单位，
运用公式进行计算。
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计算公式:
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产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×—————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml
2、酶活性单位
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定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度 时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标 准。
惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。
国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下， 每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60×106IU。
酶促反应速度明显下降，偏离线性期而进入非线性期。
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酶量的测定：
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通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准 确测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度 成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速 度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反 应速度才能准确代表酶活性。 酶促反应初速度 酶活性 酶的含量
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5、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
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酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
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米-曼氏方程：
以系统编号。数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。第一 个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚 类，第四个表示酶的编号序数。 • 如：乳酸脱氢酶属于第1大类，第1亚类，第1亚-亚类，在 第1亚-亚类中的编号为27，故此酶的专有编号为 EC1.1.127
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分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间 ·L·V标本 实际保温时间
酶单位/升 = —————————×————————
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4、酶促反应进程
酶促反应进程曲线
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职业教育医学检验技术专业教学资源库
永州职业技术学院 欧陵斌
酶活性测定的基本知识
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第一节
酶活性测定的基本知识
酶是一种生物催化剂，其化学本质是 蛋白质。它在体内含量极微，每ml仅为 pg水平，要直接测定其绝对量是十分困 难的，目前是根据其催化反应速度来定量， 称为相对定量法。
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4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率 根据米-曼氏方程可以计算 5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物 消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。
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（一）酶的结构和分类
单纯酶
酶ห้องสมุดไป่ตู้
结合酶
辅酶
辅基
分类：根据酶所催化的反应类型将酶分为氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶六大类。
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（二）酶的系统命名
• 酶的系统命名法(又称EC命名法)：即每种酶用四个数字加
类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
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表7-1
酶
某些酶的Km值
底物 Km(mmol/L)
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
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(四)Km和Vmax的测定 1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法 1 Km +〔S〕 Km 1 1 —— = ————— = ——— · —— + ——— v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
（三）、酶活性的概念
1、
酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位 v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。
时间内底物的减少量或产物的生成量。
底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
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v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
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（二）Km值的应用
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1.鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与
酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖 H2CO3 H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
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2.反映酶与底物的亲合力
Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。 3.选择酶的最适底物
Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底 物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物， 使酶促反应容易进行，并节省底物用量。
Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
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（一）米氏常数的定义 由米-曼氏方程可以导出： （Vmax-v）〔S〕 Km = ———————