转谷氨酰胺酶生产菌株的诱变选育方案
学生：
摘要：通过诱变育种选育转谷氨酰胺酶工业生产菌株，使目的菌株产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求。

关键字：筛选；工业菌株；诱变育种
前言：
工业微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造, 去除不良性质, 增加有益新性状, 以提高产品的产量和质量的一种育种方法。

工业微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等, 育种技术的不断成熟, 大大提高了微生物的育种效果。

微生物发酵要想取得优良成绩, 有赖于优良菌种的利用。

从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。

菌种选育的最终目标, 就是通过人工干预, 使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。

菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。

一．菌种选育的具体目标
(1) 提高产量。

(2) 提高产物的纯度。

减少副产物; 提高有效组分;减少色素等杂质。

(3) 改变菌种性状。

改善发酵过程, 包括: 改变和扩大菌种所利用的原料结构; 改善菌种生长速度; 提高斜面孢子化程度; 改善菌丝体形状, 采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂; 改善对氧的摄取条件, 降低需氧量及能耗; 耐不良环境: 抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物; 改善细胞透性, 提高产物的分泌能力等。

(4) 菌种的遗传性状。

生产性状稳定。

(5) 改变生物合成途径。

以获得新产品。

二．获取优良菌种的有效途径
广义上说, 菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。

菌种改良的基本途径: 突变和选择; 基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程)
MTG 生产菌株的诱变育种
诱变的方式包括了各种物理射线、化学诱变剂以及生物方面的噬箘体等等。

用得最多的是前两种，也有将几种方式混合使用的。

国内的王璋教授还曾借助“神舟”4 号飞船搭载MTG 生产菌种在外太空进行诱变实验，取得不错的效果。

一．整体育种流程
近年来，国际上有关研究MTG 生产的报道很多。

其中有些菌种是研究得较为成熟的，其代谢流程、产酶机制、生产条件、优化条件等都有详细的报道。

而这些菌株都各有特色。

所以我拟定从两株菌出发，分别进行诱变实验，最后通过原生质体融合力求将两株菌的优势整合，获得优良的MTG 生产菌株。

再视情况进行下一步的诱变选育工作。

整体诱变育种流程为：
菌A →诱变→菌A’→原生质体融合→菌株C →诱变菌B →诱变→
菌B’ →目的菌株
二．出发菌株的选定
出发菌株的选定十分重要，首先我们需要了解目的菌株所应具备的特点：产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求。

挑选以下两株菌：
（1）．茂原链轮丝菌，Streptomyces mobaraense WSH-Z2（CBS 20778）。

该菌是研究得较为成熟的MTG 生产菌株。

发酵温度、最佳pH 值、发酵机制以及优化好的培养基配方都有较详细的报道。

是一株综合性比较好的菌株。

（2）．吸水链霉菌，Streptomyces hygroscopicus WSH03-13（CCTCC M203062），系江南大学陈坚教授筛选所得。

原始菌株在培养条件优化的情况下酶活即可达到146U/ml。

是所查到的产MTG 酶活最高的链霉菌株。

三．菌种的诱变选育
1 吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 的诱变处理
由于吸水链霉菌株之前未经过诱变处理，初次宜采用致死率高的综合诱变方法，以对菌株的基因造成大的改变。

诱变处理工艺流程如下：紫外灯照射→日光
照射→NTG 诱变→30℃避光培养→37℃水浴摇床，简单的复筛测定→摇瓶培养，测酶活将该菌的单孢子悬浮液经紫外灯照射诱变后进行短时间的日光照射（光修复），然后再进行NTG 的诱变。

最后对诱变过的孢子进行避光培养。

统计死亡率、形态突变率等相关数据。

挑出经72～96h 培养后生长的菌落，继续传代培养2～3 代以纯化突变株，并初步确保菌种性能的稳定性。

将稳定的菌株作摇瓶培养后进行复筛测试，初步判断菌株的产酶情况，淘汰低产能的诱变株。

将筛得的菌株作酶活测定；从中选出酶活高的菌株，并统计正负突变率、形态变异率等相关数据。

随着诱变次数的增多，诱变剂的量也需降低；也可以先制成原生质体后诱变。

观察不同条件下的诱变效果。

最后将复筛所得的高产酶突变株进行20~30d/次的传代培养，连续5～8 代，并进行摇瓶发酵测定酶活。

测试突变株的遗传稳定性。

2 茂原链轮丝菌Streptoverticillium mobaraense 的诱变处理
诱变的程序基本同上，只是因为这株菌诱变的目的是使菌株更为适应工业生产的条件。

所以会针对各种条件设计出不同配方的选择培养基供诱变之后的筛选使用。

(1)培养基中加入MTG 酶活的阻遏物或其结构类似物。

筛选出抗阻遏物的突变株。

(2)保持在特定温度的条件下筛选培养。

选育出受温度影响较小（不因夏冬而大幅度影响生产），产酶量、酶活和生长速度都较高的诱变菌株。

(3)加入少量的青霉素或其它抗生素，选育出具抗药性的菌株，为后面的原生质体融合提供标记。

通过以上一系列的诱变筛选，将筛选出能在夏天较高的温度下仍能保持酶产量、酶活性的，具抗性标记的MTG 生产菌株。

其MTG 的生产将不受阻遏物的影响。

四．单灭活的原生质体融合
将上述两株菌的优良诱变株分别制成原生质体，其中茂原链轮丝菌的原生质体再进行5min 的60℃灭活处理。

然后将两者以107~108/ml 的浓度混合，加入适
量30~50%的分子量为1000~1500 的PEG 以及0.05mol/L CaCl2 和0.02mol/L MgCl2，在20~30℃下处理10min。

然后用高渗培养基稀释，离心除去PEG 后分离于高渗的加入青霉素的培养基上进行培养。

未经融合的吸水链霉菌的原生质体因青霉素的存在而无法生长；而未经融合的茂原链轮丝菌的原生质体已被灭活；只有融合了的原生质体才能再生。

五．挑选目的菌株
观察菌落特征，挑出再生的菌株进行摇瓶培养，通过一定的筛选流程挑选出兼具两亲株特性的优良菌株。

最后进行遗传稳定性测试。

如果这一步所得的菌株与两亲株之特性相差较远，则重复该步骤；若已与最终目的菌株相近，则将融合所得的菌株继续进行诱变实验。

以期得到更加优秀的菌株。

结果：
以上最终得到产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求的目的菌株。

参考文献：
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