▪ ②用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝； ▪ ③继续培养，每隔3~4h过滤一次，重复3~4次，
以最大限度地除去野生型细胞； ▪ ④稀释，涂平板进行分离。
高温杀菌法原理
▪ 主要是利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热敏感性 的差异。
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高温杀菌法处理方法
▪ ①让诱变后的细菌形成芽孢； ▪ ②把处在芽孢阶段的细菌转移到基本培养基中，
▪ 诱发营养缺陷型的诱变剂一般有亚硝基胍、紫 外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高， 一般可达10%以上，最高达80%。
淘汰野生型菌株
▪ 目的使营养缺陷型菌株富集，有利于检出，常用 方法有：抗生素法、菌丝过滤法和高温杀菌法。
抗生素法原理
▪ 青霉素等抗生素能抑制细胞壁粘肽组分的合成， 处在生长繁殖过程分裂期的细胞对青霉素十分 敏感，因而被杀死，但不能杀死停止分裂的细 胞。将诱变后的菌悬液分离在加有抗生素的 MM上，培养后野生型的被全部杀死，营养型 菌株由于不能生长繁殖而被保留下来，从而得 到富集。
维生素组合表
组合
维生素名称
1
维生素A 维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B12
2
维生素C 维生素B1 维生素D 维生素E 烟酰胺
3
叶酸
维生素B2 维生素D 胆碱 泛酸钙
4 对氨基苯甲酸 维生素B6 维生素E 胆碱
肌醇
5
生物素 维生素B12 烟酰胺 泛酸钙 肌醇
单一营养缺陷型的检出
生长组合和氨基酸缺陷对应表
补充培养基（SM）： 为了鉴别某一种营养缺陷型菌株，在基本培养基中加入该菌 株不能合成的营养因子的培养基。
完全培养基（CM）： 能满足各种缺陷型菌株生长的培养基。
一、营养缺陷型菌株的 分离和筛选
营养缺陷型的诱发
▪ 营养缺陷型的诱变方法与普通诱变育种基本相 同。
▪ 但是营养缺陷型是单一基因突变，所以有的诱 变剂不适合诱发营养缺陷型。如电离辐射，易 引起染色体巨大损伤。
▪ 这一步的主要目的就是鉴别其单一缺陷因子，或 双缺、三缺的生长因子。
鉴定因子
生长因子的配制方法
用于营养缺陷型鉴定的氨基酸 21种氨基酸编成6组 21种。
用于营养缺陷型鉴定的维生素 15种维生素编成5组 15种。
用于营养缺陷型鉴定的核酸碱 7种核酸碱基单一配制 基有7种。
氨基酸组合表
组别
氨基酸名称
三、营养缺陷型的鉴别
营养缺陷型的测定方法
▪ 一种方法：生长谱法，即在同一个平皿上测定一 种缺陷型菌株对许多种生长因子的缺陷情况。
▪ 另一种方法：在一个培养皿上加一种营养物质、 测定许多缺陷型菌株（10~50个）对该种生长因 子的缺陷情况。
营养缺陷型鉴定步骤
▪ ①测定缺陷型菌株所需生长因子的类别； ▪ ②测定缺陷型在该大类中具体需要哪种生长因子； ▪ ③进一步用单一生长因子进行复证试验。
对于酵母等真菌用制霉菌素处理
抗生素法处理方法
▪ ①将诱变处理的菌体在完全培养基中进行振荡培 养2~3代，以结束表型延迟现象，达到稳定的表 型和生理状况。
▪ ②收集菌体离心洗涤，然后转到基本培养基中进 行饥饿培养4~6小时，以消耗在完全培养基中摄 取而储存在体内的氮素营养，使其停止生长，否 则也会被青霉素杀死。
▪ ③再转移到含无机氮的基本培养基中培养3~4 小时，使野生型细胞刚刚进入对数期，加入一 定浓度的青霉素，大量野生型细胞瓦解、死亡， 释放出细胞内的许多物质，其中有的被缺陷型 作为营养利用而得以继续生长，最终也被青霉 素破坏，造成缺陷型筛选率大为下降。为防止 这种现象的发生，可以在基本培养基中加入 20%蔗糖，以提高渗透压，使死亡的野生行细 胞处于高渗透液的包围中，阻止原生质体破裂。
▪ ④在基本培养基和完全培养基上涂平板，比较两 种培养基上菌落的差数。在基本培养基上不长的 就是营养缺陷型菌株。
菌丝过滤法原理
▪ 真菌和放线菌都是丝状菌，其野生型孢子在基本 培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型孢子则 不能萌发。
菌丝过滤法处理方法
▪ ①将诱变处理后的孢子移入基本培养液中，振荡 培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉 眼可见；
0.5%左右的脱氧胆酸钠，或在基本培养基中用山 梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖使菌落长得小而 密； ▪ 第二，克服孢子扩散带来的不纯现象。用薄纸覆 盖代替影印。
（三）夹层法
（四）限量补给法
▪ 将处理后的菌液涂布在含微量（0.01%或更少） 营养补充剂（如蛋白胨）的基本培养基上，营养 缺陷型长得慢，菌落小；野生型长得快，菌落大， 可筛去野生型。
1 缺陷型菌株所需类别的测定
▪ 通常用以下物质代表类别物质： ▪ ①酵母浸出液，其中有AA、Vitamin、核酸碱基。 ▪ ②氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨 ，代表氨
基酸组。 ▪ ③维生素混合物，代表维生素组。 ▪ ④核酸碱基混合液或酵母核酸，代表嘌呤、嘧啶
类。
营养缺陷型类别的测定
2 缺陷型所需生长因子的测定
第四节 营养缺陷型菌株的筛选
▪ 原养型菌株：即野生型菌株，可以合成生长所需 的各种营养物质。
▪ 营养缺陷型：指营养缺陷型菌株经过诱变或自然 突变失去合成某种营养成分的能力，只有在基本 培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
培养基类型
基本培养基（MM）： 能维持野生型菌株正常生长的培养基。营养贫乏，氮源是由 一些无机物组成，碳源只能用纯净的蔗糖或葡萄糖。
组
组合的生长因子
1 赖氨酸 精氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 亮氨酸 异亮氨酸
2 缬氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 组氨酸
3 苏氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 谷氨酸 脯氨酸 天冬氨酸
4 丙氨酸 胱氨酸 酪氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丝氨酸
5 鸟氨酸 亮氨酸 色氨酸 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺
6 胍氨酸 异亮氨酸 组氨酸 天冬氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺
振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺 陷型芽孢不萌发； ▪ ③将培养物加热到80℃，野生型细胞大部分被杀 死，缺陷型则保存下来，起到浓缩的作用。
二、营养缺陷型的检出
（一）点植对照检出法
（二）影印法
丝绒印模
本法适用于细菌、酵母菌以及小型菌落的放线菌和霉菌。
值得注意的是
▪ 采用影印法进行霉菌缺陷型检出时，要注意两点： ▪ 第一，防止菌落扩散和蔓延，可在培养基中加入