• 3.离子交换剂的性质. 3.离子交换剂的性质. 离子交换剂的性质 • 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, • 引起pH变化,降低交换容量. 引起pH变化,降低交换容量. pH变化 • 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 缓冲液必须不影响被分离物质的测定
• 2.按其载体分类 按其载体分类 • (1)离子交换树脂 离子交换树脂: 离子交换树脂 • 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂. 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂 • 聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状 结构. 结构
• 交联剂 二乙烯苯 交联剂:二乙烯苯 • 二乙烯苯 • 交联度 交联度= ———————— ×100% • 苯乙烯+二乙烯苯 苯乙烯 二乙烯苯 • 苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交 联度的树脂. 联度的树脂 • 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大 获得的树脂交联度就 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大,获得的树脂交联度就 越大. 越大 • 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小 大分子量的离子就 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小,大分子量的离子就 不能进入树脂颗粒内发生离子交换. 不能进入树脂颗粒内发生离子交换 • 交联度的范围从 ～16% 交联度的范围从1%～
• 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 离子与离子交换剂上的功能基团 的过程. 的过程
离子交换过程示意： 离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子
完成
•
带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多 带电荷量少 亲和力小的先被洗脱下来;带电荷量多 亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多, 亲和力大的后被洗脱下来. 亲和力大的后被洗脱下来
• b.交换容量 交换容量: 交换容量 • 指树脂能进行交换的能力,主要决定于树 脂网状 指树脂能进行交换的能力 主要决定于树 含的碱性或酸性基团的数目. 结构内所 含的碱性或酸性基团的数目 以mmol/ml 表之. 或 mmol/g 表之 •
• (2)纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂: 纤维素离子交换剂 • 在纤维素分子结构上连接一定的离子交换基团 就成为离子交换纤维素. 就成为离子交换纤维素 • (3)离子交换凝胶 — 分离大分子物质 离子交换凝胶 • 如: 葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、聚丙烯 葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、 酰胺离子交换剂. 酰胺离子交换剂 •
• 一.离子交换剂 离子交换剂: 离子交换剂
• 在惰性载体上引入(以共价结合的方式 带有电荷的 在惰性载体上引入 以共价结合的方式)带有电荷的 以共价结合的方式 活性基团. 活性基团
• 1.按其带电荷的功能基团分类 按其带电荷的功能基团分类 • (1)阳离子交换剂 阳离子交换剂: 阳离子交换剂 • 载体上带有负电荷的功能基团,能结合溶液中的正电 载体上带有负电荷的功能基团 能结合溶液中的正电 负电荷的功能基团 荷. • (2)阴离子交换剂 阴离子交换剂: 阴离子交换剂 • 载体上带有正电荷的功能基团,能结合溶液中的负电 正电荷的功能基团 载体上带有正电荷的功能基团 能结合溶液中的负电 荷.
• 二.原理 原理
•
离子交换层析是以离子交换剂 离子交换剂(具有离子交换性能 离子交换层析是以离子交换剂 具有离子交换性能 的物质)作为固定相,利用它与流动相(洗脱剂 中的离子 的物质 作为固定相 利用它与流动相 洗脱剂)中的离子 作为固定相 利用它与流动相 洗脱剂 中的 能进行可逆交换的性质,来分离离子型化合物的一种方 可逆交换的性质 能进行可逆交换的性质 来分离离子型化合物的一种方 法.
• 阳离子交换树脂 Dowex 50为固定相，由于天冬氨酸 阳离子 为固定相， 为固定相 柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合 带负电荷不与树脂结合， 在 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合， 首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷， 首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷，与树脂紧密降低 赖氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。 赖氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。 • 氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。 氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。因此可将 收集到的水溶液与茚三酮试剂反应， 收集到的水溶液与茚三酮试剂反应，观察其是否生成 蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量. 蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量.
• (二)试剂 • 1.离子交换树脂 Dowex 50 型 1.离子交换树脂 • Dowex 50 为强酸型阳离子交换树脂. 颗粒直径 为强酸型阳离子交换树脂 297µm，以带负电荷的磺酸基团（— SO3H）为功能基 磺酸基团 ，以带负电荷的磺酸基 的影响。 团，它的解离不受外界溶液 pH 的影响。磺酸基团能 够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。 够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。
• 离子交换树脂指标 交联度、交换容量 离子交换树脂指标: 交联度、 • a.交联度 交联度: 交联度 • 交联剂所占的百分比称为交联度.范围从 交联剂所占的百分比称为交联度 范围从 1%～ 16%. 交联度小 分子结 构较疏松 孔径大 交联度小,分子结 构较疏松,孔径大 ～ 量较大的离子性物质.交联度 适用于 分离分子 量较大的离子性物质 交联度 大,孔径 小适用分离分子量小的物质 孔径 小适用分离分子量小的物质. • 目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 目数： Dowex 50 为20-50目 目 20 840µm µ 50 297µm µ 100 149µm µ 代表二乙烯苯的百分含量） （代表二乙烯苯的百分含量）
• (二)缓冲液的选择 二 缓冲液的选择 缓冲液的选择:
• • 原则: 原则 不能发生化学反应,避免使样品发生 变性. 不能发生化学反应 避免使样品发生 变性
• 考虑因素: 考虑因素: • 1.被分离物质的稳定性. 1.被分离物质的稳定性 被分离物质的稳定性. • 蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性. 蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性. • 2.在此缓冲溶液的pH条件下,被分离物质所带的 2.在此缓冲溶液的pH条件下 在此缓冲溶液的pH条件下, • 电荷性质与交换剂上的平衡离子相等. 电荷性质与交换剂上的平衡离子相等.
• 树脂所含的交换基团性质分为两类 树脂所含的交换基团性质分为两类: • a.阳离子交换树脂 阳离子交换树脂: 阳离子交换树脂 • 能与溶液中阳离子交换,树脂带负电荷. 树脂带负电荷 能与溶液中阳离子交换 树脂带负电荷 • b.阴离子交换树脂 阴离子交换树脂: 阴离子交换树脂 • 能与溶液中阴离子交换,树脂带正电荷. 能与溶液中阴离子交换 树脂带正电荷 树脂带正电荷 • 根据阳离子和阴离子交换树脂中功能基团的酸碱解离 程度分为强、弱两种: 程度分为强、弱两种 • (a)强酸型阳离子交换树脂 强酸型阳离子交换树脂: 强酸型阳离子交换树脂 • 主要以磺酸基( 为功能基团,它的解离不受外 主要以磺酸基 R-SO3) 为功能基团 它的解离不受外 界溶液的影响. 界溶液的影响
• 2.洗脱液 2.洗脱液 • （1） pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液 • 天冬氨酸 pI 2.97 ＜ pH 4.2 柠檬酸钠缓冲 液带负电荷。 液带负电荷。 • 赖氨酸 pI 9.74 ＞ pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液 带正电荷。
• (2)0.1 mol/L NaOH
离子交换层析分离氨基酸及其测定
• (一)原理
• 氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pI）。 氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pI）。 在溶液 pH 小于其 pI 值时均带正电荷，反之则带负 值时均带正电荷， 电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液， 电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液， 分别属于酸性氨基酸（ 2.97）和碱性氨基酸（ 分别属于酸性氨基酸（ pI 2.97）和碱性氨基酸（ pI 9.74）。 ）。在 4.2柠檬酸钠缓冲液中 天冬氨酸、 柠檬酸钠缓冲液中， 9.74）。在pH 4.2柠檬酸钠缓冲液中，天冬氨酸、赖 氨酸各带有负电荷和正电荷。 氨酸各带有负电荷和正电荷。以强酸型
• 三.操作注意点 操作注意点: 操作注意点
• 1.离子交换剂的选择 离子交换剂的选择: 离子交换剂的选择 • 选择原则:根据被分离物质的性质选择 — 同一性质离 选择原则 根据被分离物质的性质选择 子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异 子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异 的型号的交换剂. 大的型号的交换剂
离子交换层析
• 概述： 概述： • 用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、 用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、 寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。 寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。 • • • 特点：⑴具有开放性支持骨架 特点： ⑵具亲水性 ⑶多孔性
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离子交换层析是以离子交换剂为固定相， 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定 的含离子的溶液为流动相， 的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分 差异， 离的各种离子结合力的差异 离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子 进行分离的层析技术。 进行分离的层析技术。
• ( c )强碱型阴离子交换树脂 强碱型阴离子交换树脂: 强碱型阴离子交换树脂 • 功能基团含三甲胺的称为强碱 I 型,含二甲基乙醇胺 含二甲基乙醇胺 称为强碱 II 型. • pH条件都不受限制 条件都不受限制. 条件都不受限制 • 典型交换方程式 典型交换方程式: • RN(CH3)3 + NaOH →RN(CH3)3OH +NaCl • (d)弱碱型阴离子交换树脂 弱碱型阴离子交换树脂 • 以伯胺基( -NH )、仲胺基(＝NH )、叔胺基 、仲胺基 ＝ 以伯胺基 、叔胺基(≡N )或吡 或吡 啶基为功能基团,交换能力随溶液的 条件而变化, 交换能力随溶液的pH条件而变化 啶基为功能基团 交换能力随溶液的 条件而变化 pH 越低交换能力越强. 越低交换能力越强 • 典型交换方程式 典型交换方程式: • RNH3OH + HCl →RNH3Cl + H2O