荧光 黄色
360,450 420
酶在食品分析中应用
为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa？
（1）成本低 （2）热稳定性好 （3）显色反应类型多
酶在食品分析中应用
2.4 ELISA技术在食品分析中的应用
近年来，ELISA因其操作程序的规范化、简单化 和检测的高灵敏性，在农药残留、兽药残留、 重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人 畜共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安 全性检测领域正逐步推广应用。
酶在食品分析中应用
（1）毒素检测
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，其中的 十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒 性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致 癌能力最强的是黄曲霉毒素。它在自然界中分 布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在 一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食 品和饲料中。
法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应
用于临床检验、食品、环境等生物及其它样品
的检测。
酶在食品分析中应用
1. 酶法分析的特点及应用类型
酶的特性 催化效率高
酶法检测的特点 快速
灵敏性强
专一性
特异性、准确
不需要物理分离，干扰少
酶在食品分析中应用
酶在食品分析中的应用类型
1. 去除样品中的杂质。如测定果糖、多糖等。 2. 催化待测物生成新的产物，而这种产物更容
第10章 酶在食品分析中的应用
主要内容： 1 酶法分析的特点及应用类型 2 酶联免疫测定（ELISA） 3 聚合酶链式反应（PCR） 4 酶生物传感器 5 酶抑制率法
酶在食品分析中应用
酶法分析的发展
酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪中期。 当时，曾采用麦芽提取物作为过氧化物酶源， 以愈创木酚作为共底物或指示剂测定过氧化氢。
易被定量分析。如：淀粉的测定。 3. 测定食品中酶的活性作为食品的指标，如过
氧化物酶的测定。 4. 利用酶催化反应所产生的一些信息。如酶联
免疫法、酶电极法等。
酶在食品分析中应用
2 酶联免疫测定（ELISA）
酶 联 免 疫 测 定 （ enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）是继放射免疫测定技术之后发 展起来的一项新的免疫学技术。
然而，酶法分析真正的发展应归于它在临床实 验室中的广泛应用。
酶在食品分析中应用
酶法分析的发展
如早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中 的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突 破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为 诊断肝病和心脏病的一个有效手段。
到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶
酶标板
酶在食品分析中应用
2.2 ELISA的基本类型
随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用， 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体 条件，逐渐演变出了几种不同类型的检测方法：
（1）夹心法；
（5）捕获法测IgM抗体；
（2）间接法；
（6）ABS-ELISA法；
（3）竞争法；
（7）PCR-酶联免疫测定法；
后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。
酶在食品分析中应用
2.3 ELISA测定中酶的作用
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反 应的结果，使测定具有极高的灵敏度。
酶在食品分析中应用
（1）酶标记的抗体或抗原的制备
酶标记的抗体或抗原是ELISA中最关键的试剂。 良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持 了抗体或抗原的免疫活性。
ELISA自上世纪70年代出现开始，就因其高度 的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快 以及费用低等优点，在临床和生物疾病诊断与 控制等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛 应用的方法之一。
酶在食品分析中应用
2.1 ELISA的基本原理 重点
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测 物与酶连接（或建立关联）。
（4）双位点一步法； （8）斑点免疫酶结合试验。
酶在食品分析中应用
双抗体夹心法
（1）双抗体夹心法
此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相
载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温
育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。
酶在食品分析中应用
乙肝表面抗原。
间接法
（2）间接法ELISA 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸
酶标记抗体的制备主要有戊二醛交联法和过碘 酸盐氧化法两种方法。酶结合物一般需经离子 交换层析或分子筛分离纯化。
酶在食品分析中应用
（2）常用的酶及底物
酶
底物
显色反应 测定波长
辣根过氧化物酶
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺
2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
（2）酶标记的抗原或抗体（标记物）；
必需
（3）酶作用的底物（显色剂）；
（4）阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准 品和控制血清（定量测酸盐缓冲液）
（7）酶反应终止液。（常用硫酸）
酶在食品分析中应用
酶标仪和酶标板
DNM-9602A酶标分析仪
（2）通过酶与底物产生颜色反应，用于 定量测定。
它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专 一性有机地结合起来，可对生物体内各种微 量有机物的含量进行测定。测定的对象可以 是抗体也可以是抗原。
酶在食品分析中应用
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与 之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶 标抗抗体)和底物进行测定。
酶在食品分析中应用
竞争法
（3）竞争法
黄曲霉素
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测 定抗体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；
加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与
待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最
492 460
449 425 642
4-硝基酚磷酸盐(PNP)
黄色
400
为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa？ 碱性磷酸酯酶
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖
红色
500
黄色
405
葡萄糖氧化酶
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
蓝色
420
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) β-Ｄ－半乳糖苷酶 硝基酚半乳糖苷(ONPG)