实验一722 型分光光度计的性能检测一、目的1、学会使用分光光度计2、掌握分光光度计的性能检验方法二、提要1、分光光度计的性能好坏，直接影响到测定结果的准确性，因此新购仪器及使用一定时间后，均需进行检验调整。

2、利用KMnO4溶液的最大吸收峰值来检验波长的精度。

3、用同种厚度的比色皿，由于材料及工艺等原因，往往造成透光率的不一致，从而影响测定结果，故在使用时须加以选择配对。

三、仪器与试剂1、722 型分光光度计；2、小烧杯；3、坐标纸；4、滴管；5、擦镜纸；6、KMnO4溶液；四、操作步骤1、吸收池透光率的检查（测定透光率）吸收池透光面玻璃应无色透明，并应无水、干燥。

检查方法如下：以空气的透光率为100%，则比色皿的透光率应不低于84%，同时在450nm、650nm 处测其透光率，各透吸收池透光率差值应小于5%。

2、吸收池的配对性（测定透光率）同种厚度的吸收池之间，透光率误差应小于0.5%。

检查方法如下：将蒸馏水分别注入厚度相同的几个吸收池中。

以其中任一个比色皿的溶液做空白，在440nm 波长处分别测定其它各比色皿中溶液的透光率，然后选择相差小于0.5% 的吸收池使用。

3、重现性（光度重复性）（测定透光率）仪器在同一工作条件下，用同种溶液连续测定7 次，其透光率最大读数与最小读数之差（极差）应小于0.5%。

检查方法如下：以蒸馏水的透光率为100%，用同一KMnO4溶液连续测定7 次，求出极差，如小于0.5%，则符合要求。

4、波长精度的检查（测定A）为了检查分光系统的质量，可用KMnO4溶液的最大吸收波长525nm 为标准，在待检查仪器上测绘KMnO4溶液的吸收曲线。

检查方法如下：取3.0×10-5mol/L 的KMnO4溶液，以蒸馏水为空白，在460nm~580nm 范围内，分别测定460、480、500、510、520、522、524、525、526、528、530、540、550、560、570、580nm 波长处的吸光度，在坐标纸上绘出吸收曲线。

若测得的最大吸收波长在525±10nm 以内，说明该仪器符合要求。

五、数据处理2、吸收池的配对性以吸收波长为横坐标，吸收度A 为纵坐标绘制吸收曲线。

六、思考题1、在本实验中共用了几种空白溶液，分别是什么？2、使用722 或721 型分光光度计时，应注意哪些问题？1）仪器预热时应将光闸门处于关的位置，可避免光电倍增管照光，延长光电倍增管的使用寿命。

2）如果大幅度改变测试波长时，需要等数分钟，才能正常工作。

因波长大幅移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢。

3）每台仪器上所配套的吸收池不能与其他仪器上的吸收池单个调换。

4）吸收池每次使用完毕后，应立即用蒸馏水洗净，用吸水纸擦干，存于吸收池盒内。

3、同种比色皿透光率的差异对测定有什么影响？4、检查分光光度计的波长精度及重现性对测定有什么实际意义？实验二药物中微量铁的测定一、目的1、掌握使用分光光度计2、了解分光光度法测定药物及水中铁含量的操作方法及原理。

3、学会用工作曲线法测定样品含量。

二、提要铁是药物和水中常见的一种杂质，含量大时易产生特殊气味，因此对药物和水中的铁要进行检查和测定。

亚铁离子与邻二氮菲生成稳定的橙红色配合物。

应用此反应可测定铁，当铁以Fe3+离子形式存在于溶液中时，可预先用还原剂盐酸羟胺将其还原为Fe2+离子。

2 Fe3++2NH2OH·HCl→2 Fe2++N2↑+2H2O+4H++2Cl-显色时溶液PH 值应在2~9，若酸度过高（PH﹤2）显色缓慢而色浅；若酸度过低，二价铁离子易水解。

最大吸收波长为508nm，ε =11100。

三、仪器与试剂722 型分光光度计；容量瓶25ml 8 只；吸量管1ml，2ml，5ml，10ml 各1 只；吸收池、擦镜纸；洗耳球；小烧杯；万分之一天平；标准铁溶液（10µg.ml-1）；邻二氮菲水溶液（0.075%）；盐酸羟胺5%水溶液（用时配制）；NaAc（0.5mol·L-1）；HCl（6mol·L-1）。

四、操作步骤1、标准曲线的制作在 6 只25ml 容量瓶中，用吸量管分别加入0.0，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0ml 铁标准液（10µg·ml-1），分别精密加入1ml盐酸羟胺，5ml NaAc溶液，2ml邻二氮菲，用水稀释至刻度后摇匀，放置10分钟。

用1cm比色皿，以试剂为空白（即0.0ml铁标液），在508nm波长下，测量各溶液的吸光度。

以铁含量为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

2、待测样测定准确吸取待测样5.00ml，置25ml 容量瓶中。

按上述制备标准曲线的方法配制溶液并测定吸光度，根据测得的吸光度求出水中总铁量。

据水样测得的吸光度计算水中铁含量。

以铁含量为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线，并根据测得样品的吸光度，计算水中总铁量。

A0.40 10 30 50 70 90 (μg/25mL)C 未= X/5 = Y μg/ml四、注意事项1、测定时由低浓度至高浓度方向测定，可以直接省略蒸馏水润洗过程2、吸收池中装样高度：至2/3 处即可。

五、思考题1、本实验中采用的空白溶液为什么?2、显色反应操作中，加入各标准溶液与样品的含酸量不同，对显色有无影响？3、根据制备标准曲线测得的数据，判断本次实验所得浓度与吸光度间的线性好不好。

分析其原因。

实验三、四紫外吸收曲线和工作曲线的测绘及含量测定一、目的1、掌握紫外-可见分光光度计的使用。

2、掌握吸收曲线的绘制方法。

3、学会从吸收曲线找到最大吸收波长。

4、掌握标准曲线的绘制方法及应用。

5、学会用紫外-可见分光度计测定中药有效成分的含量。

二、仪器与试剂美谱达可见-紫外分光光度计；容量瓶10ml6只（棕色瓶1只）；吸量管1ml，2ml，5ml 各1 只；吸收池、擦镜纸；洗耳球；小烧杯，滴管；95%乙醇；橙皮苷标准液10 μg/ml；待测陈皮母液浓度为60 μg/ml。

三、操作步骤1、配制溶液分别精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 标准溶液至10ml 容量瓶，用95%乙醇定容，摇匀备用。

2、吸收曲线的测绘（目的：找出最大吸收波长）在系统主菜单中选择“光谱扫描”项进行吸收曲线的测绘。

1）基线的建立：取空白溶液（95%乙醇）分别盛装于比色皿后，分别放置在仪器比色架参比池以及样品池位置上。

按照仪器使用方法进行操作，完成一系列设定[扫描设置（起点、终点、间隔、速度）、测定模式（吸光度模式）、Y 轴坐标]后，点击100T/0Abs，建立一条系统基线。

2）测定吸收曲线：将3 号橙皮苷标准液放置于样品池位置，点击START/STOP，进行测量。

测得吸收曲线后，点击检索，用方向键（上下移动键）查看波峰的波长，记录最大吸收波长（278nm 左右）。

3、工作曲线的测绘在系统主菜单中选择“定量测量”项进行工作曲线的测绘。

1）基线的建立：取空白溶液（95%乙醇）分别盛装于比色皿后，分别放置在仪器比色架参比池及样品池位置上。

按照仪器使用方法进行操作，完成一系列设定（最大吸收波长、浓度单位、各标样浓度）后，点击100T/0Abs，机器自动调整到曲线测定波长，并调零。

2）测定工作曲线：将样品按顺序依次放入光路中，点击START/STOP，测得吸光度。

测量完成后，点击ESC 返回标准曲线设定界面。

在最下方可见到系统给出的曲线方程及方程相关系数。

点击曲线查看标准曲线。

4、待测液测定（求出橙皮苷的百分含量）点击ESC 返回定量测量界面，开始测量未知样品浓度。

机器根据测得的吸光度，运用公式，自动计算出浓度。

四、数据处理1、吸收曲线测绘结果C = μg/mL；A = ；λmax = nm回归方程：相关系数：3、待测液测定结果C x = μg/mL；A =4、陈皮中橙皮苷百分含量计算橙皮苷% = C x/C 陈皮⨯ 100% = C x/C 陈皮⨯ 100% =五、思考题如何应用UV-Vis 分光光度法完成中药有效成分的含量测定？实验五柱色谱法分离净化生物碱一、目的1、掌握色谱柱的制备方法。

2、熟悉用柱色谱分离净化生物碱的过程和方法。

二、提要氧化铝是一种吸附力较强的吸附剂，具有分离能力强、活性可以控制等优点。

根据氧化铝的的特点，采用95%乙醇作为流动相可以起到分离净化生物碱的目的。

三、仪器与试剂色谱柱（长15cm，内径1.3cm）2 根；带橡皮套的玻璃棒2 根；50ml 量筒1 个；精制棉及圆形滤纸；剪刀；磨口三角瓶30ml 2 个；25ml 容量瓶2 个；铁架台，蝴蝶夹；黄连；95%乙醇；氧化铝。

四、操作步骤1、色谱柱的制备准备2根洁净干燥的高15cm、内径1.3cm的色谱管，于管底垫一层精制棉（不要太紧），垂直夹在滴定台上，然后把待测氧化铝通过一干燥小漏斗，仔细装入色谱管中至高达约6cm 处（约6g），用一带橡皮套的玻璃棒轻轻地均匀地敲打只氧化铝的高度达约5cm处，然后在其表面覆以圆形滤纸一层即得。

2、黄连提取液的配制方法取10g黄连（粉碎），加95%乙醇没过药材，回流15分钟，滤过，滤液补加乙醇定量到50mL 容量瓶中。

3、盐酸小檗碱类生物碱的分离净化打开活塞，于色谱柱中加入黄连提取液1ml，待溶液全部通过后，立即以95%乙醇20ml 淋洗色谱柱，控制流速为20～30 滴/min。

流出液收集于25ml 量瓶中，最后稀释至刻度。

观察和记录色谱柱中溶液的颜色。

五、注意事项1、精制棉用量要少，要平整，但不要塞得太紧，以免流速过慢。

2、色谱柱必须具有均匀的紧密度，表面应力求水平，样品应小心地加入，勿使氧化铝表面受到扰动。

实验六铺板硅胶Ｇ薄层板的制备称取硅胶Ｇ1.5g、蒸馏水4.5ml，在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，立即倒在玻璃板上，用研钵研头稍加涂匀，然后用左手持玻璃板，用右手中指在背面轻轻敲击玻璃板，使铺成平坦均匀的薄板。

于室温下，置水平台上晾干，于110℃烘30 分钟，冷却后即使用或放入干燥器备用。

同学们下次实验请带尺子和铅笔！！七生物碱的薄层色谱鉴定一、目的1、掌握薄层硬板的制备方法。

2、掌握薄层色谱的一般操作方法。

3、了解薄层色谱在中药分析中的应用。

二、提要奎宁、辛可宁属于生物碱类成分，利用薄层色谱可将二者分离，用对照品加以对照，可起到鉴别奎宁、辛可宁的作用。

三、仪器与试剂层析缸；玻璃板5×15cm ；点样毛细管2µl ；研钵；喷雾瓶50ml，皮老虎；电吹风；台秤；量筒10ml；烘箱；磨口小三角瓶；硅胶G（薄层层析用）；奎宁，辛可宁对照品；氯仿；乙酸乙酯：无水乙醇：二乙胺（7：1：1）；改良碘化铋钾试液。

四、操作步骤1、点样一般用点样器或定量毛细管点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0~1.5cm，点样直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。