伊曲康唑脂质体体外抗真菌作用研究魏华1，刘艳1，董迪1，宋笑丹2，吴琳华1*(1. 哈尔滨医科大学附属第二医院药学部；黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨 150086；2. 哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，哈尔滨 150001)摘要目的研究伊曲康唑脂质体体外抗深部真菌作用。
方法参照美国临床实验室标准化协会(CLSI，曾经名为NCCLS)推荐的M27-A2方案微量液基稀释法，测定伊曲康唑脂质体、伊曲康唑注射液的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)，采用平皿菌落计数法绘制杀菌曲线。
结果伊曲康唑脂质体与伊曲康唑注射液相比，对56株受试菌株的MIC、MFC 和杀菌曲线相似。
结论伊曲康唑脂质体保持了与市售伊曲康唑注射液相似的体外抑菌、杀菌活性，具有良好的体外抗真菌作用。
关键词伊曲康唑；脂质体；最小抑菌浓度(MIC)；最小杀菌浓度(MFC)；杀菌曲线In Vitro Antifungal Activity of Itraconazole LiposomeWEI Hua1，DONG Di1，SONG Xiao-dan2，WU Lin-hua1*(1. Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, KeyLaboratory of College in Heilongjiang Province, Harbin 150086, China; 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)ABSTRACT：OBJECTIVE To study the antifungal activity of Itraconazole Liposome in vitro. METHODS According to the reference M27-A2 broth microdilution method recommended by the clinical and laboratory standards institute (CLSI; formerly NCCLS) subcommittee, assay the minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal fungicidal concentration (MFC) of Itraconazole Liposome and Itraconazole Injection, killing curve was drown by calculating the colony number . RESULTS MIC, MFC and killing curve of Itraconazole Liposome against 56 fungi were similar to those of Itraconazole Injection in experiments. CONCLUSION Itraconazole Liposome retained similar antifungal activity as Itraconazole Injection. Itraconazole Liposome has significant action in inhibiting fungi and fungicidal effect and excellent antifungal activity in vitro study experiments.KEY WORDS：itraconazole；liposomes ;the minimal inhibitory concentration (MIC) ;the minimal fungicidal concentration (MFC) ;killing curve作者简介：魏华，女，硕士研究生* 通讯作者：吴琳华，女，博士，教授，硕士生导师Email：wulinhua1985@所属专业：药剂学伊曲康唑（itraconazole，ITZ）是三唑类广谱抗真菌药物，通过抑制真菌细胞膜必需成分麦角固醇的生物合成而发挥其抗真菌作用[1]，对深部真菌感染疗效较好[2]，是近数十年来抗真菌药物治疗的一个很大进展[3]。
伊曲康唑注射液长期大量应用会造成体内药物蓄积，将伊曲康唑制成脂质体的剂型可以更好地发挥其疏水性，减少用药剂量，提高其生物利用度，提高伊曲康唑在靶器官的浓度[4]。
本实验考察了伊曲康唑脂质体对临床常见五种深部真菌体外抗真菌活性，并与市售伊曲康唑注射液进行比较，为进一步开发伊曲康唑脂质体提供实验依据。
1 材料1.1药物与试剂伊曲康唑原料药(寿光富康制药有限公司，纯度99.0%，批号：070308)；伊曲康唑脂质体(本室自制)；伊曲康唑注射液(比利时杨森公司，规格：每支25 mL，含伊曲康唑0.25 g，批号：7DB0W01); TritonX-100 (Sigma公司)；卵磷脂(北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20070412)；胆固醇(北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20071108)；二甲基亚砜 (Beyotime分装，碧云天生物技术研究所)；吗啡啉丙磺酸(广州威佳公司)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)。
1.2菌种白色念珠菌16株，克柔念珠菌10株，光滑念珠菌10株，近平滑念珠菌10株，热带念珠菌10株，均为临床分离株，菌株经特殊试验鉴定后保存在-80℃冰箱内直到使用。
药敏质控的标准菌株近平滑念珠菌ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258。
以上菌种均由哈尔滨医科大学附属第二医院检验科提供。
1.3 培养基RPMI1640液体培养基: RPMI1640粉末10.4 g溶解于900 ml双蒸水中，加入MOPS 34.53 g (使其终浓度为0.165 mol·L-1)，搅拌溶解。
用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至7.0 (25 ℃)，定容至1000 ml，用0.22 µm无菌微孔滤膜过滤，4 ℃保存备用。
沙堡氏琼脂培养基(SDA)：葡萄糖2%、蛋白胨1%、琼脂2%，蒸馏水配制，灭菌后备用。
1.4 仪器生物安全柜(上海跃进医疗器械厂)；BUCHIEL161旋转蒸发仪(瑞士布琪有限公司)；KQ3200E医用超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)；DHP-2000型恒温培养箱(天津市华北实验仪器有限公司)；涡旋混合器(天津市富兰斯电子科贸有限公司)；XB-K-25型血细胞计数板(浙江省玉环县求精医用仪器厂)；8001-75型电子显微镜(北京永新诺华科技有限公司)。
2 方法与结果2.1伊曲康唑脂质体的制备采用薄膜超声分散法制备伊曲康唑脂质体。
精密称取一定量卵磷脂、胆固醇和伊曲康唑原料药，溶解于20 mL氯仿中，置250 mL茄形瓶中，45 ℃减压蒸发成膜，加入20 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液水化1 h，水浴超声40 min，即得伊曲康唑脂质体，4 ℃保存。
2.2抗真菌药物稀释液的制备取一定量伊曲康唑原料药，加入适量二甲基亚砜溶解，制成伊曲康唑质控储备液，-80℃保存备用。
用RPMI 1640液体培养基分别对伊曲康唑脂质体、伊曲康唑注射液和伊曲康唑质控储备液进行稀释，制成终浓度为64 µg . mL-1的抗真菌药物稀释液和质控药物稀释液，所有稀释液均临用现配。
2.3菌悬液的制备将受试真菌接种在SDA平板上，置35 ℃孵箱，传代培养。
挑取生长24 h直径1 mm左右的菌落5个悬浮于装有5 mL生理盐水的无菌试管中，置于涡旋混合器上振荡15 s，混匀，并用血细胞计数板对其进行真菌数量计数。
用无菌生理盐水调节菌悬液浓度，使其终浓度为1×106 cfu. mL-1。
再用RPMI1640液体培养基对菌悬液作1:20稀释，再进行1:50稀释。
2.4药物敏感性试验[5]取一次性无菌U型底96孔板，各孔加入100 µL RPMI1640，然后在第1孔加100 µL药物稀释液，横向进行10级倍比稀释，每排第11孔为阳性对照孔(只含菌液，不含药液)，第12孔作为生长对照孔(只含RPMI1640)，再向各孔加入100 µL菌悬液。
使药物终浓度为16 -0.0313 µg . mL-1，菌液终浓度为0.5×103 cfu .mL-1。
2.5最小抑菌浓度(MIC)测定药敏板置35 ℃孵箱孵育48 h。
用视觉法判定终点[6]：96孔U型底培养板各孔充分混匀后与生长对照孔比较，当有≥ 50 %浊度降低时所对应的最低药物浓度为最小抑菌浓度。
实验所测的质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258对伊曲康唑质控稀释液的MIC值均与NCCLS规定的MIC值相符合，证实本实验条件符合NCCLS的有关规定，所测定的实验结果可信。
伊曲康唑脂质体和伊曲康唑注射液对56株念珠菌的MIC范围、MIC50、MIC90测定结果见表1。
表1伊曲康唑脂质体和伊曲康唑注射液对56株念珠菌的MICs Tab1The MICs of itraconazole liposome and itraconazole injection真菌株数药物 MIC范围/µg·mL-1MIC50/µg·mL-1MIC90/µg·mL-1白色念珠菌16 ITZ脂质体0.03-8 0.125 4ITZ注射液0.06-8 0.125 4 克柔念珠菌10 ITZ脂质体0.12-2 0.25 2ITZ注射液0.12-2 0.5 2 光滑念珠菌10 ITZ脂质体0.06-8 0.5 8ITZ注射液0.12-8 1 8 近平滑念珠菌10 ITZ脂质体0.03-0.25 0.03 0.12ITZ注射液0.03-0.25 0.06 0.25 热带念珠菌10 ITZ脂质体0.03-0.125 0.03 0.25ITZ注射液0.03-0.25 0.03 0.252.6最小杀菌浓度(MFC)测定从“2.5”项下视觉法观察未见真菌生长各孔，分别取50 µL液体，接种于无菌SDA平板，35 ℃孵箱孵育24 h，菌落数少于5 个的最低药物浓度即为最小杀菌浓度。
伊曲康唑脂质体和伊曲康唑注射液对56株念珠菌的MFC范围、MFC50、MFC90测定结果结果见表2。