临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。

然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。

国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。

本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。

一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。

临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。

（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。

又称霉菌（mold）。

临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。

（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。

这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。

二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。

（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。

其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。

在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。

（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。

配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。

设置耐化学品和消毒剂腐蚀的防护用品及器材。

（三）气流要求实验室宜设计负压或定向气流，主实验室气流应由清洁区送入操作区。

生物安全柜为Ⅱ级，其高效过滤器对于直径为0.3 μm的微粒过滤效率不低于99.99%[2]。

（四）消毒措施的管理工作台面可用5%石碳酸或0.5%过氧乙酸或含氯消毒剂（500 mg/L）消毒。

如遇操作台被真菌或标本污染，应立即覆盖纸巾，并用5%石碳酸或含氯消毒液（2 000 mg/L）消毒20 min。

切忌用水冲洗，以免污染扩散[3]。

高压灭菌效果建议使用指示条以及生物指示剂进行监测。

（五）医疗废物的管理真菌培养标本及污染物在丢弃前，需做好生物安全防护，废弃物的容器或包装材料应当符合防水、防破损、防外泄的要求，特别是丝状真菌，建议用医用胶布或透明胶带密封后高压灭菌[4]。

实验室废物的最终处置应交由经当地环保部门资质认定的医疗废物处理单位集中处置。

（六）丝状真菌处理的生物安全要求丝状真菌的检测需在Ⅱ级生物安全柜内进行，特别是可疑高致病性病原真菌（荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌等），严格执行《病原微生物实验室生物安全通用准则》进行操作及处理[5]。

BSL-2级临床微生物实验室不建议对高致病性真菌进行大量活菌的操作（如大量活菌的传代培养，药敏试验等）[5,6]。

三、人员要求临床微生物实验室真菌专业组人员配置应根据开展的真菌检测项目及工作量适当配置。

人员要取得检验相关上岗证，经过真菌岗位的基本培训（岗前培训、持续培训）和工作能力的评估。

培训内容至少包括：（1）生物安全，实验室设施设备安全使用，检测前、中、后的风险及突发事件的处理；（2）检测技能，所开展检测项目的基本原理、参考区间、质量控制、结果影响因素和实验室信息系统的使用等；（3）伦理和患者信息的保密等。

能力评估包括：（1）常规工作的过程和程序以及安全操作；（2）设备维护和功能检查；（3）检验结果的记录和报告过程；（4）核查工作记录和解决问题的技能等。

评估方法：对新进的员工，在最初6个月内应至少进行2次能力评估，其他员工应每年进行1次能力评估，并对每位员工的评估结果进行记录，并据此授予相关检测权限。

四、仪器和试剂要求（一）对实验室仪器和设备的要求真菌实验室应根据各自医院的规模和诊治对象的不同需求，配备符合工作要求的仪器和设备[7]。

仪器设备要求见表1。

仪器装机后，在临床使用前，应按照说明书对各仪器的关键性能进行相应的验证和评价，如对检测准确度、精密度、可报告范围等进行验证，性能验证通过后方可用于临床检测。

生物安全柜应根据使用频率定期（每年至少1次）进行安全性能检测，必要时更换高效滤膜或进行甲醛熏蒸消毒[4]。

（二）对实验室检测试剂的要求真菌相关实验室检测试剂，应满足国家对检验试剂的相关要求，实验室应按照制造商或相关指南、规范的说明和建议储存试剂。

商品化试剂或实验室自制试剂都需要在使用前严格进行性能验证，实验过程中做好质量控制。

五、检测技术要求真菌检测技术包括形态学检查、培养、鉴定、药敏试验、免疫学检测、分子生物学检测等。

直接涂片镜检简便、快速，能够在各级医院开展，经染色后镜检可更为清晰地观察其形态学特征，对临床诊断具有重要价值。

合格标本（无菌部位尤其血培养的临床价值高）经培养后根据菌落大小、形态、颜色可初步判断，并进一步做鉴定和药敏试验。

使用显色平板和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可缩短检验周期，提高鉴定准确性。

分子生物学检测灵敏度高，血培养的特异性强。

联合抗原（隐球菌抗原、G试验、GM试验）和抗体检测等多种真菌实验室检测技术的合理应用（多次检测、联合检测），结合临床病史、症状体征及影像学检查，有助于早期诊断侵袭性真菌病。

常见真菌病的微生物学诊断方法建议见表2。

（一）标本采集处理各类标本的采集与处理要求如下。

1．血液：推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒战期取静脉血。

采集后立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。

至少采集2套。

采血量与培养基比例为1/10~1/5（必须包括需氧瓶或真菌专用瓶）。

2 h内常温送检。

若不能及时送检，则常温保存。

严格执行皮肤消毒程序可有效降低血培养的污染率。

双相血培养瓶（含肉汤加琼脂斜面）较单纯肉汤培养基更早发现阳性[16,17]。

2．骨髓液：使用肝素化的注射器或溶解离心管采集骨髓液0.5 ml（儿童）至3 ml（成人）后送检。

15 min内常温送检。

若不能及时送检，则常温保存，已出现凝聚的标本不能送检。

骨髓液真菌培养可采用裂解离心培养系统（如Isolator）或商业化的真菌自动化培养系统（如专用的真菌血培养瓶），少量骨髓可直接接种到培养基中。

标本采集和接种操作需严格遵守实验室规范或商品说明书。

实验室人员还需关注骨髓中大量白细胞产生CO2可能导致的培养瓶假阳性。

骨髓涂片非常重要，需做吉姆萨或瑞氏染色镜检。

播散性的念珠菌、隐球菌及曲霉感染都可能累及骨髓[3]。

3．无菌体液（脑脊液、心包液、腹腔积液和关节液）：除脑脊液外，其余的无菌体液宜置于含肝素的无菌真空采血管，15 min内送检，若不能及时送检，则常温保存（不能冷藏）。

部分新型隐球菌在37 ℃不生长，建议接种二管分别置25 ℃及37 ℃[16]。

脑脊液可直接接种于血培养瓶，提高阳性率。

也可同时作隐球菌荚膜抗原检测。

4．脓液、引流液、创面分泌物及窦道：开放性创口，用无菌生理盐水冲洗创面后，采集病灶活动性边缘坏死组织标本及分泌物。

封闭性脓肿，局部皮肤消毒后用注射器抽取脓血性液体送检。

2 h内常温送检。

如有颗粒应以无菌生理盐水漂洗后采集颗粒并记录颗粒的颜色，压碎后镜检及培养。

标本通常可作KOH湿片、革兰或荧光染色，发现真菌菌丝或孢子具有诊断意义[16,17]。

较浓稠的标本需使用消化液处理。

5．下呼吸道标本（深部痰液，支气管肺泡灌洗液）：清洁口腔后采集晨痰，采用支气管毛刷取样和采集支气管肺泡灌洗液。

推荐采集至少3份痰液标本，可以提高阳性检出率，支气管肺泡灌洗液对于非艾滋病患者检测耶氏肺孢子菌是最佳标本，对于艾滋病患者诱导痰或常规痰标本具有与支气管肺泡灌洗液相同的敏感性。

唾液或24 h痰液都不推荐作真菌培养。

支气管冲洗液因含较多的定植真菌也不宜作真菌培养。

标本2 h内室温送检，若不能及时送检，则4 ℃保存。

呼吸道标本液化后离心取沉渣检测可以提高阳性率。

临床怀疑组织胞浆菌和皮炎芽生菌感染时，标本建议尽快送检。

6．口腔及口咽部标本：采用无菌生理盐水湿润的拭子轻轻刮取黏膜损害表面，作KOH或荧光染色涂片，同时种于含氯霉素的沙氏琼脂或念珠菌显色培养基。

口咽部感染最常见的真菌为念珠菌。

不推荐采用鼻腔拭子，可以采用鼻腔组织及鼻窦冲洗液标本。

7．眼（角膜刮片、玻璃体液等）：一般由临床医生操作。

15 min内常温送检。

若不能及时送检，则常温保存。

角膜刮片直接接种至不含抑制剂的培养皿中，采用X或C型涂菌方式；玻璃体液离心后取沉淀物接种。

眼内标本一般量较少，操作时须严格无菌，防止污染。

8．组织标本：采集标本后用无菌容器转运，如标本量较少，应滴加几滴无菌生理盐水保湿。

及时送检，若不能及时送检则室温保存。

培养标本使用无菌眼科剪将标本剪成米粒大小后接种，对标本作研磨后接种可以增加标本与培养基的接触面积，同时也能使组织胞浆菌等一些胞内菌释放出来提高培养的阳性率；怀疑接合菌感染的组织则直接剪碎后接种，研磨可能会破坏菌丝降低其生长活力。

组织标本可作KOH或荧光染色涂片，能及时发现真菌成分，帮助临床诊断，尤其对一些不能人工培养的真菌如鼻孢子菌，瘢痕疙瘩样芽生菌等，同时可接种于沙氏琼脂。

9．尿液：采集早晨第1次清洁尿液、耻骨上联合穿刺尿液或导管尿液10~50 ml。

不能采用24 h尿液。

2 h内常温送检，若不能及时送检，则4 ℃保存，但不能超过72 h。

尿液真菌培养不推荐定量检测菌落计数，因其与疾病的严重程度相关性存在争议。

10．生殖道标本：男性患者可用无菌特制的尿道拭子伸入尿道口内2 cm，用足够压力旋转5~10 s；女性患者采集阴道、宫颈分泌物，在阴道扩张器帮助下用无菌拭子插入宫颈口1.5 cm 处采集，拭子取出时不要碰到阴道壁，放入无菌管中立即送检。

标本量一般较少，要防止干燥，影响致病菌的存活率。

取阴道分泌物前避免性生活及阴道冲洗与用药。

11．粪便：置无菌容器内立即送检。

挑取含脓血、黏液部分的标本，如遇液状宜取絮状物。

应在2 h内送检，标本置放时间过久可因粪便中细菌繁殖抑制了致病真菌的生长。

一般不推荐粪便作真菌检查，因考虑肠道内可以有念珠菌正常菌群，除非标本镜检发现大量的菌丝及菌落生长。