第5卷第3期北华大学学报(自然科学版)Vol.5No.3 2004年6月JOURNAL OF BEIHUA UN IV ERSIT Y(Natural Science)J un.2004文章编号:100924822(2004)0320257207植物耐盐性研究进展于海武1,李　莹2(1.北京林业大学生物科学与技术学院,北京　100083;2.北华大学林学院,吉林吉林　132013)摘要:综述了植物的耐盐机理和植物耐盐育种的研究情况,讨论了耐盐基因工程研究中存在的一些问题,并重点对现有植物的耐盐性筛选和抗渗透胁迫基因工程中的诱导渗透调节剂合成做了论述.关键词:耐盐性;耐盐机理;基因工程;渗透调节剂中图分类号:S332.6 文献标识码:A　盐碱土是陆地上分布广泛的一种土壤类型,约占陆地总面积的25%.在我国,从滨海到内陆,从低地到高原都分布着不同类型的盐碱土壤[1],我国盐碱土的总面积约有3000多万hm2,其中已开垦的有600多万hm2,还有2000多万hm2盐荒地等待开垦利用[1].此外,全国约有600多万hm2,约占耕地总面积10%的次生盐渍化土壤.盐碱土主要分布在平原地区,地形平坦,土层深厚,一般都有较丰富的地下水源,对发展农业生产,尤其对于实现农业机械化、水利化极为有利,是一类潜力很大的土壤资源.目前,人们主要通过2种方式来利用盐碱地:1是通过合理的排灌、淡水洗涤、施用化学改良药剂来改造土壤[2],为植物创造有利的生长环境.实践证明,这种方法成本高,效果也不理想;2是选育和培育耐盐植物品种来适应盐渍环境并最终达到改善环境的目的,此方法更加具有应用前景.1　植物的耐盐机理植物耐盐性差别很大.根据植物耐盐能力的不同,可将植物分成非盐生和盐生植物2类.赵可夫等又将盐生植物分为3类:真盐生植物、泌盐盐生植物和假盐生植物[1].目前大部分的耐盐性研究工作都是以真盐生植物为基础开展的,所以对它的耐盐机理也就研究得比较多.近年来,在筛选和培育耐盐细胞系、转移渗透调节剂合成基因、合理利用盐诱导基因等方面都开展了许多研究工作,并取得了一些成果.许多研究表明:植物要适应盐渍化的生境,必须具备克服盐离子毒害(离子胁迫)和抵抗低水势(渗透胁迫)的能力,否则就无法生存[3,4].马建华等认为:植物在高盐土壤中主要先受到水分胁迫,而后就是离子胁迫[5].所以在耐盐机理中人们对离子区隔化和渗透调节做了相对较多的研究.1.1　离子区隔化许多真盐生植物通过调节离子的吸收和区隔化来抵抗或减轻盐胁迫.在植物体内积累过多的盐离子就会给细胞内的酶类造成伤害,干扰细胞的正常代谢.研究表明,盐胁迫条件下,植物细胞中积累的大部分无机离子被运输并贮藏在液泡中,使得植物因为渗透势降低而吸收水分,同时,避免了过量的无机离子对代谢造成的伤害,这就是离子的区隔化.在耐盐植物和非耐盐植物中都存在离子区隔化,这说明离子区隔化可能是植物所普遍具有的能力[6].盐的区隔化作用主要是依赖位于膜上的“泵”实现离子跨膜运输完成的[7,8].这种运输系统需要A TP酶,A TP水解产生能量将H+“泵”到液泡膜外,造成质子电化学梯度,驱动钠离子的跨膜运输,从而实现盐离子的区隔化.Na+积累于液泡维持了细胞质中较低的Na+/K+比例也是植物耐盐的特点之一[9].收稿日期:2003212204基金项目:国家“973”计划项目(G1999016005)作者简介:于海武(1977-),男,在读硕士,主要从事杨树抗逆性育种研究.852 北华大学学报(自然科学版)第5卷1.2　渗透调节渗透调节能力是植物耐盐所必须拥有的特点[9].植物有2种渗透调节方式:1是在细胞中积累和吸收Na+,K+,Ca2+,Cl-等无机离子[10],2是植物对盐渍适应的同时还能在细胞中积累一定数量的可溶性有机物质,作为渗透调节剂共同进行渗透调节,以适应外界的低水势.可溶性有机物质包括以下几类:氨基酸、有机酸、可溶性碳水化合物、糖醇类.Zhao等认为无论是无机离子还是有机相容物质都在植物的耐盐过程中发挥着重要作用[11].张新春等指出,虽然植物合成有机类调节物需要消耗大量的能量,但这些有机物质对细胞内酶类的保护和植物的生长都是必需的[12].1.3　维护膜系统的完整性在盐胁迫条件下,细胞质膜首先受到盐离子胁迫影响而产生胁变,导致质膜受伤.龚明等发现:高盐分浓度能增加细胞膜透性,加快脂质过氧化作用,最终导致膜系统的破碎[13].其次,盐胁迫还会使植物产生活性氧,启动膜脂过氧化作用,从而给植物造成伤害.POD,CA T,SOD是植物体内的保护酶系统,它们相互协调,共同协作,清除膜脂过氧化作用产生的MDA,最终达到保护膜结构的作用[14～16].郑海雷等发现:减轻脂质过氧化作用和SOD保护作用是植物耐盐的主要过程[17].1.4　改变代谢途径在盐分胁迫下,植物的代谢就会受到干扰而发生紊乱,而一些盐生植物则能够通过改变其自身的代谢途径适应高盐分生境.獐毛和日中花经高盐胁迫后分别将本身的C3途径改变成C4和CAM途径[18].2　植物耐盐育种的研究培育耐盐植物品种是利用盐碱地的一条有效途径,植物耐盐分子机制的研究和生物技术的日臻完善,给培育高效耐盐植物带来了曙光.进行植物耐盐碱育种要有明确的目标和方向.现在,科学工作者们基本按照以下途径开展耐盐育种工作:1)通过品种间杂交等常规手段选育耐盐品种;2)对现有植物物种进行耐盐性筛选;3)利用现代生物技术创造新的耐盐品种[19].其中,杂交等常规育种方法是获得稳定遗传耐盐品种的最可靠的方法,但利用传统的常规育种方法至今尚未培养出真正有效的耐盐品种.通过其余2种途径进行耐盐育种的报道较多,尤其是生物技术方法育种更是当今的研究热点.2.1　对现有植物进行耐盐性筛选众所周知,各类植物之间的耐盐性是不同的,发现和利用现有耐盐物种是改变盐碱土壤环境最便捷的手段.然而人们希望在改善盐土环境的同时,还要取得一定的经济效益,所以国内、外的研究人员对现有各类作物和林木物种开展了很多耐盐性的测定工作:国外主要对经济作物和造林树种进行耐盐性的测定和比较[20～23];国内的研究人员有的选材于小麦、棉花、西红柿等作物,有的选材于林木进行植物耐盐性研究[24～31],都取得了一定的研究成果.植物的抗性鉴定是一个非常复杂的技术问题,它不仅受外界条件的影响,而且不同植物、不同品种、不同生育阶段的抗盐能力也不一样.从国内、外的情况看,大体有2种鉴定方法:直接鉴定法和生理鉴定法.其中,直接鉴定就是通过评定盐处理后植物的发芽情况、形态、产量等表现性状来决定植物的耐盐性.由于植物的耐盐机理尚未清楚,目前对植物耐盐性尚无统一的生理指标,所以这种鉴定结果只能作为参考.但是如果能找出植物耐盐代谢的生理指标测定的规律性,无疑将对植物的耐盐研究起到巨大的推动作用. 2.2　利用现代生物技术育种现代生物技术涉及组织培养、体细胞变异、体细胞杂交、基因工程等方面.正是由于生物技术的蓬勃发展,使得耐盐育种的方式获得了极大的丰富,加快了耐盐品种的选择培养过程.近几年来,植物抗渗透胁迫基因工程研究进展十分迅速.当植物受到盐分胁迫时会发生离子运输的改变、许多具有渗透保护作用的有机小分子的积累、蛋白质组成分改变等一系列生理生化反应[32].植物主要通过调节有机小分子物质含量和离子的吸收区隔化等途径来维持渗透压的平衡.1)诱导相容性溶质的生物合成.渗透调节剂合成是较少的已经完成生化、遗传和转基因研究的胁迫反应.目前,通过基因工程手段,能使细胞内积累甜菜碱、山梨醇、甘露醇、海藻糖等相容性溶质,不同程度地提高转基因植物(烟草、草莓、水稻等)的耐盐性.本文就近来研究比较多的合成糖醇、甜菜碱、脯氨酸的关键酶基因做一概述.糖醇(Sugaralcohols ).糖醇是1种多元醇,含有多个羟基,亲水能力强,能有效地维持细胞内的水活度,但其作为渗透调节剂的分子机制还不完全清楚.它在细胞质中盐离子浓度或高或低时,所扮演的角色不同.它们在植物界中普遍存在,在正常生理生化代谢中,由光合作用或呼吸作用的中间产物转化而成并能在细胞中积累.在盐胁迫条件下,许多植物都会合成并积累糖醇.最近,国外的学者Michell 报道,将来源于大肠杆菌的12磷酸甘露醇脱氢酶基因(MtlD )转入烟草,转基因植物中能够合成和积累甘露醇,从而表现出对1.45%NaCl 的抗性[33].1995年,我国的刘俊君也用此基因来转化烟草和玉米获得了耐盐的转基因植株[34].随后国内有将大肠杆菌起源的GutD 转入玉米中使得植株体内积累山梨醇,并表现出较高的耐盐性的报道[35].甜菜碱(G lycine 2betanine ).在盐渍和干旱的环境下,许多植物都会产生胁迫应答反应,在细胞中积累甘氨酸、甜菜碱类物质,使得细胞的正常膨压得以维持.在藜科、早熟禾科等植物中盐胁迫下的甜菜碱积累更为明显[36].如同其他有机分子一样,甜菜碱对细胞质中的酶类无毒性,它的积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下保持活性[37].在植物中,甜菜碱由胆碱经2步氧化得到,2步反应均发生在叶绿体基质中.参与催化第1步反应的酶是胆碱单氧化物酶(CMO ),第2步反应是甜菜碱醛脱氢酶(BADH ).这样,如果通过基因工程手段向植物中定向转入甜菜碱相关基因,就能使那些在盐胁迫下不积累甜菜碱的植物发生甜菜碱累积,就有可能获得较强的抗渗透胁迫的能力[38].在人们进行转基因工程研究之前,首先要假设作为渗透调节剂的甜菜碱的合成是耐盐胁迫的一个限制因子.Saneoka 等比较了玉米的甜菜碱合成型和缺陷型之间的耐盐性发现:甜菜碱合成型的玉米在125mmol NaCl 胁迫下,能够保持正常的生长,这可能说明细胞中合成和积累的甜菜碱起到渗透保护的作用[39].中科院遗传所的刘凤华、郭岩等将来源于耐盐性很强的藜科植物山菠菜的BADH cDNA 转入了水稻、草莓和烟草中,得到的转基因植物分别能在0.5%,0.4%～0.7%和2%的NaCl 中正常生长,而对照组则不能[40].国内、外近期不但报道了BADH 转化的研究[41],而且还进行了较多的codA 基因的转化研究工作,转入codA 基因的烟草等植株的耐盐性都有提高[42,43].与此同时,科学家们也进行了木本植物的转化研究,日本的G ao 等在2000年第1次将codA 基因转进柿树,达到了提高其耐盐性的目的[44].脯氨酸(Proline ).脯氨酸被认为是植物在渗透胁迫下容易积累的1种相容渗透剂,它可以起到提高细胞内渗透势、保护细胞蛋白质结构和防止酶变性的作用.另外,它还是植物去除盐胁迫恢复正常过程中有效的氮原、碳原和还原剂[45].脯氨酸在植物中的积累首先依赖于体内合成.植物中脯氨酸的合成有2条途径:谷氨酸途径和鸟氨酸途径[46].两者的主要区别在于底物的不同,植物受到盐胁迫和缺少氮原的情况下主要发生谷氨酸途径,而该途径的关键限速酶是吡咯琳252羧酸合成酶(P5CS ),这在Szoke 等将拟南芥脱水和复水过程中,发现脯氨酸含量的上升和下降与P5CS 基因的mRNA 水平的消长成比例时得到证明[47].因此,通过转入P5CS 基因来增加非盐生植物细胞中脯氨酸的量可能会提高其抗渗透胁迫的能力.1999年,苏金等用乌头叶菜豆P5CScDNA 植物表达质粒转化水稻,得到的转化水稻幼苗具有一定的抗高盐能力[48].同年,Ray WU 获得转基因水稻中提高了P5CSmRNA 和脯氨酸的水平,秧苗也出现了耐盐特性[49].Sawahel 等人通过花粉管法把P5CScDNA 导入小麦,测定其已经整合到植物染色体组上,证明了脯氨酸具有渗透保护剂的功能,并且有效地提高了小麦的耐盐能力[50].至于果聚糖和海藻糖在植物耐盐性提高的作用具有不确定性,通过Elilabcth ,Pilon 2Smits ,Hendry 等的研究表明它们在抵抗干旱中能起更加重要的作用.渗透调节剂合成酶基因的亚细胞定位.最近的许多研究发现:渗透保护物质的正确定位对于其作用的发挥至关重要[51].Bohnert 等也建议不同有机溶剂应该对应不同的亚细胞位置,这样会得到更好的耐盐效果[52].渗透保护物质有的定位于细胞质中(如脯氨酸),有的定位于液泡(如果聚糖)中.对菠菜的研究发现:甜菜碱的合成在叶绿体中进行,从原生质体溶解物中制备的叶绿体具有很高的氧化胆碱的能力.Hayashi 等人将胆碱氧化酶基因codA 与叶绿体导向肽序列结合构成嵌和基因来转化水稻,比起单独转化codA 基因更为有效地提高了水稻耐盐性[53].国内也有人报道将甘露醇合成过程定位在叶绿体中使抗性增加[54].另有报道,在转基因水稻中,将codA 基因定位在叶绿体和胞质溶胶中,经NaCl 胁迫后表明:定位于叶绿体的转codA 水稻对盐害下光抑制有着更高的耐受性,同时这也可能预示了在转基因植物中,甘氨酸甜菜碱的生物合成的亚细胞区隔化对胁迫耐性加强方面起决定作用[55].952第3期于海武,等:植物耐盐性研究进展 062 北华大学学报(自然科学版)第5卷2)调节离子的吸收和区隔化.耐盐植物调节离子的吸收和区隔化主要通过处于细胞质膜和液泡膜上的各种离子泵来完成.最近研究发现:超量表达HAL基因可以调节K+运输.盐离子的积累会进一步影响细胞的代谢作用,使得植物代谢过程发生胁变,细胞的生理功能受到不同程度的破坏.另外,植物在吸收矿物元素的过程中,盐离子与各种营养元素相互竞争造成矿质营养胁迫,打破了植物体内的离子平衡,严重了影响植物的正常生长.由于植物细胞离子均衡受到破坏以及高Na+对植物代谢的毒害,其直接的保护机制应是降低Na+的毒害,调节细胞的K+/Na+比率,维持其高K+低Na+的离子均衡.HAL基因就是这样一个关键基因[56,57].HAL1基因最早是从啤酒酵母中克隆获得的,它是通过调节阳离子转移系统而使得植物获得耐盐性的,过量表达该基因的酵母转化后可耐高达150mol/L的NaCl胁迫,而剔除该基因则大大降低酵母的耐盐性;HAL1基因提高酵母的耐盐性是增加细胞内K+含量,降低细胞内Na+含量,从而调节酵母细胞的K+/Na+比率[58,59].我国学者将酵母的HAL1基因转入拟南芥中比较转基因植株和野生型植株表型无区别,测定K+,Na+浓度发现:转基因植株在盐胁迫下含有更少的Na+[60].Bordas等率先将HAL1基因导入菜瓜,提高了转基因植株在组培条件下的耐盐性[61].随后,G isbert和张荃等先后将来源于酵母的HAL1基因转进番茄中并且转基因植株表现出较好的耐盐性[62,63].Arrillagada等将酵母的HAL2基因转入番茄中,证实了该基因的正面效应,进一步获得转基因植株的子代测定后表明其耐盐水平比对照组要高[64].G ervera等将来源于酵母的HAL2基因第1次转入木本植物柑桔中,检测已经稳定整合并且表现出了较高的耐盐性[65].3　耐盐基因工程研究存在的主要问题1)植物的耐盐性是1个多基因控制的性状,因此,植物可以通过多个基因的转移获得更好的耐盐性[66].但是多个基因的转移对于载体的启动因子、可携带基因的长度、基因间是否拮抗就有较高的要求.许多研究表明:通过改变转录因子基因的表达,同时改变几个目的基因表达水平是可以实现的[67].2)现在所应用的基因多数是从细菌、酵母菌、水稻、拟南芥、烟草、山菠菜等生物中分离克隆出来的,而且针对这些生物的转化试验也做得比较多.相对来说,源于木本植物的耐盐基因以及有关木本植物耐盐基因转化成功的报道较少,这大大减少了盐碱土地综合利用的效率.参考文献:[1]赵可夫,冯立田.中国盐生植物资源[M].北京:科学出版社,2001.32～43.Zhao K efu,Feng Litian.Chinese Halophyte S ource[M].Beijing:Science Press,2001.32～43.[2]林凤栖,李冠一.植物耐盐性研究进展[J].生物工程进展,2000,20(2):20～25.Lin Fengqi,Li Guanyi.Research Progress in Salt Tolerance in Plants[J].Progress in Biotechnology,2000,20(2):20～25.[3]Greeenway H,Munns R.Mechanisms of Salt Tolerance in Non2halophytes[J].Plant Physiol,1980,131(1):149～190.[4]Munns R,Termaat A.Whole Plant Res ponses to Salinity[J].Plant Physiol,1986,13(1):143～160.[5]马建华,郑海雷,赵中秋,等.植物抗盐机理研究进展[J].生命科学研究,2001,5(3):175～179.Ma Jianhua,Zheng Hailei,Zhao Zhongqiu,et al.Research Progress in Mechanism of Plant Risistance to Salt 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iotechnology College of Beiji ng Foresty U niversity ,Beiji ng 100083,Chi na ;2.Forest ry College of Beihua U niversity ,Jili n 132013,Chi na ;)Abstract :The research progress on salt tolerance mechanisms and breeding of plant was reviewed.Some questions existing in salt 2tolerance genetic engineering were discussed.The screening of salt tolerance plant and synthesis of osmotic regulating agents in genetic engineering of osmotic stress tolorance were summarized.K ey w ords :Salt 2tolerance ;Salt tolerance mechanism ;G enetic engineering ;Osmotic regulating agents【责任编辑:郭伟】362第3期于海武,等:植物耐盐性研究进展 。