安徽理工大学医学院教研室审阅意见：（教研室主任签名）年月日（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注荧光免疫技术(fluoroimmunoassay)是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法，其将免疫学反应酶异性与荧光技术的敏感性结合起来。

基本原理是：利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上以一定的条件与标本中的待测抗原特异性地结合，通过高发光效率的点光源，经过滤色板发出一定波长的光，使标本结合的荧光素激发而产生荧光，借助荧光显微镜来进行观察，可以判断待测抗原或抗体的有无。

荧光免疫技术被广泛地应用于临床检测和科学研究。

第一节荧光的基本知识一、荧光现象荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短的时间内发射出的波长大于激发光波长的光。

二、荧光技术中有关的概念和参数1．发射光谱指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。

2．激发光谱指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。

3．荧光效率荧光物质不会将全部吸收的光能都转变成为荧光，荧光效率是指荧光物质将吸收的光能转变序为荧光的百分率。

荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）不同的荧光物质各有其特定的吸收光谱和发射光谱，即在某一特定波长处有最大吸收峰和最发射峰。

选择激发光波长在最接近于荧光物质的最大吸收峰的波长，而且测定光波长也设定在最接近于最大发射光波峰时，可得到最高的荧光效率。

4．荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。

5．荧光的猝灭指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。

一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，用以消除（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注不需要的荧光。

在荧光免疫技术中常用的荧光猝灭物质有亚甲蓝、碱性复红、伊文思蓝以及低浓度的过锰酸钾和碘溶液等。

6．荧光偏振荧光偏振可用下式说明P=（F H－F L）/（F H＋F L）式中：P表示偏振度；F H表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度：F L是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。

当P=0时，说明完全不偏振；P在－1至 +1之间即为部分偏振。

三、荧光物质在荧光免疫技术中常用的荧光物质有：1．异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)最大吸收光波长为490～495 nm，最大发射光波长520～530 nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。

2．四乙基罗丹明(rhodamine，RB200)最大吸收光波长为570 nm，最大发射光波长为595~600nm，呈桔红色荧光。

可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。

3．四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)最大吸收光波长为550 nm，最大发射光波长为620 nm，呈橙红色荧光。

4．藻红蛋白(R-RE)最强吸收光波长为565 nm，最大发射光波长为578 nm。

R-RE可以有效地与FITC一起共用488 nm激发光，常用于双色免疫荧光染色。

其他荧光物质有：1．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。

Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，适用于时间分辨荧光免疫测定。

2．酶作用后产生荧光的物质(荧光底物)某些化合物本身无荧光效应，但经酶作用后所形成的物质则是强荧光物质，可以用于酶免疫荧光分析。

第二节荧光抗体的制备基本内容辅助手段和时间分配备注荧光抗体是将荧光素(如FITC)与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成的。

一、抗体与荧光素的结合用于标记的抗体应具有高特异性及高亲合力；应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易解离，而未结合者易于清除；与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。

常用的标记蛋白质与荧光素的结合方法有搅拌法和透析法两种，纯化方法可采用透析法或层析分离法。

二、标记抗体的纯化标记抗体完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素，纯化方法可采用透析法或层析分离法。

三、去除过度标记的蛋白结合的荧光抗体，并不是均一的，有的过量结合，有的未结合。

过量结合者是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用，两者皆应去除。

荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(F ／P)，其测定和计算方法是：将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别测读A280(蛋白质特异吸收峰)和标记荧光素的特异陬收峰，按公式计算。

(FITC)F／p=(2.87×A495)/(A280-0.35×A495)(RB200)F/P= A515/A280F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。

一般用于经过固定的标本的染色，荧光抗体以F/P=1．5为宜，用于活细胞染色者以F/P=2.4为宜。

将适当的F／P值的标记蛋白收集可用于不同的实验。

四、除非特异反应抗体和鉴定荧光抗体活性其目的是去除那些非期望抗体或交叉抗体，即去除嗜异性抗体。

可采用肝粉吸收法，用于吸收的脏粉最好是与试验标本同种的动物脏器。

荧光抗体活性的鉴定可用琼脂双扩散法对抗体效价进行滴定，荧光抗体的琼脂双扩效价一般大于1：16。

第三节免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术的基本原理是：荧光抗体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质进行鉴定。

基本内容辅助手段和时间分配备注一、标本的制备荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定位。

在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中抗原应尽量不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。

标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。

常见的临床标本主要有：组织、细胞和细菌三大类。

按不同标本可制作成涂片、印片或切片。

组织材料可制名成石蜡切片或冷冻切片，石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等原因已很少在荧光显微技术中应用。

组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。

细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。

二、荧光抗体染色根据染色的方法不同可将免疫荧光技术分为不同的实验类型，主要有：直接法和间接法。

直接法是将荧光素标记在已知的特异抗体上，直接与待检的组织片相应的抗原反应。

其优点握方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

间接法的染色程序分为两步：第一步，用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原片上，在湿盒中37℃保温30 min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。

第二步，加上荧光标证的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。

如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会禾已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

间接法也可用于检测抗原，其先将已知的特异抗体(第一抗体)与待检的组织片作用，再用荧光标记的抗球蛋白抗体(第二抗体)探测特异抗体(第一抗体)是否与待检的组织片中的抗原结合判定组够片中是否有相应的抗原存在。

三、荧光显微镜检查经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。

荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。

其主要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线能聚光器和镜头等，根据光路又可分为透射光及落射光两种形式。

荧光显微镜检查要选择好光源和滤光片。

观察FITC标记物可选用激发滤光片BGl2，配以吸收滤光片OG4或GG9。

（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注观察RB200标证物时，可选用BGl2与OG5配合。

阳性细胞的数量和荧光强度均可作为荧光显微镜检查的定量或斗定量的指标。

第四节免疫荧光技术在医学检验中的应用荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等方面。

在细菌学检验中主要用于细菌的鉴定，标本材料可以是培养物、感染组织、病人分泌排泄物等。

与其他鉴定菌的血清学方法比较，免疫荧光法较快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能一种补充手段使用，而不能代替常规诊断。

色疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。

免疫荧光法还检测自身抗体的良好工具，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。

（教案末页）小结荧光的基础知识，免疫荧光技术在医学检验中的应用。

荧光抗体的制备：抗体与荧光素的结合、标记抗体的纯化、荧光抗体活性鉴定。

荧光显微技术：标本制作、荧光抗体技术的主要类型及原理，荧光色素、荧光效率、荧光抗体、荧光寿命的概念。

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