稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。

实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。

实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。

因此平板菌落计数的结果往往偏低。

为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。

实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。

实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。

(2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。

棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。

然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45o角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。

(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。

2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。

另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

(2) 稀释用1m1无菌吸管吸取1m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。

将多余的菌液放回原菌液中。

将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。

另取一支1m1吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。

吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。

用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。

……其余依次类推，整个过程如图所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。

3．平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。

(1) 浇注平板培养法1) 取样用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。

不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

2) 倒平板尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15毫升／平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并己冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

(2) 涂布平板计数法：平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。

二者操作基本相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30 min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24—48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

4．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。

同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。

实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。

由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。

一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

下面是食品中微生物的计数，可能包含多种菌（二）倾注培养1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。

同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。

如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。

倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。

培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。

培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h 后，培养基失重不应超过15％。

5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。

在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。

（三）计数和报告1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。

可用肉眼观察，必要时用检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。

2．到达规定培养时间，应立即计数。

如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。

4．若所有稀释度均不在计数区间。

如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。

如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。

有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。

5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。

如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。

如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。

再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，菌落数为37750时，即可写成3．8×105。

固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。