目录第一章样品制备 21.1 一般性原则 21.2 样品制备程序 3 1.2.1 培养细胞样品处理方法 31.2.2 组织样品处理方法 31.2.3文献报道较多的裂解液配方 4第二章第一向等电聚焦（IEF） 72.1 IPG胶条的水化和电泳 72.1.1 仪器 72.1.2 试剂 72.1.3 实验步骤 72.2 IPG胶条的平衡 92.2.1 仪器 102.2.2 试剂 102.2.3 实验步骤 10第三章第二向SDS电泳 123.1 垂直SDS-PAGE 123.1.1 溶液 123.1.2 灌胶步骤 123.1.3 电泳步骤 14第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 154.1 考马斯亮兰染色 154.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 154.1.2 Neuhoff胶体考染法 154.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 164.2 硝酸银染色 16Appendix I Troubleshooting 18Appendix II Solutions 232DE分析流程：样品制备（Sample preparation）固相pH梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）第二向SDS电泳（SDS-PAGE）检测染色（Detection/Staining）第一章样品制备（Sample Preparation）1.1一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。

目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。

当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。

通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。

在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。

大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。

样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。

脂类和多糖都可以通过超速离心除去。

透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

1.2样品制备程序：1.2.1培养细胞（culture cell）样品处理方法：培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。

裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.其他常用的裂解缓冲液如下：(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;(C) 加入0.3-1% SDS在95o C煮样品5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。

总蛋白抽提程序：（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof管中，吸干残留的PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100µL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5）4o C，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C备用。

1.2.2组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。

但遵循的原则基本相同。

下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1）在液氮中研碎叶片；（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20o C的冰浴；（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4o C，40,000g, 1h），弃上清；（4）重悬沉淀浮于含0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；（5）离心（4o C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4o C，40,000g, 1h）。

（7）Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C 备用。

超速离心法：（1）取材；（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；（3）组织悬液15℃，10 000×g离心10 min；（4）上清液4℃，150 000×g超速离心45 min；（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min；（6）取离心上清。

Bradford法定量，分装后置–75℃保存。

1.2.3 文献报道较多的裂解液配方Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of proteaseinhibitors)Final concentration Amount9 M 10.8 gUrea (FW 60.06,Sigma, >99.5%)CHAPS (FW 614.89,4% (w/v) 0.8 gSigma, >98%Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail ofprotease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 gCHAPS 4% (w/v) 0.8 gTris base (FW 121.1)Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final conc. AmountUrea 5 M 3.0 gThiourea (FW 76.12) 2 M 1.52 gSB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 gCHAPS 2% 0.2 gUltrapure H2O to 10 mlA cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加tris可不用此混合物）成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF 35 μg/ml or 1 mMEDTA 0.3 mg/ml (1 mM)抑肽素0.7 μg/ml亮肽素0.5 μg/ml其中C-F是分步法提取的4种裂解液配方, C适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。

欲了解更详细的样品制备信息，可参考：/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.第二章第一向等电聚焦（IEF）双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。

IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。

可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。

IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。