细菌内毒素标准品的稀释
➢ CP2010年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡 混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前要 至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求；
➢ 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀 分布
➢ 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效 价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝 等不正确的实验结果
2、将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素 检查用水溶解 ，在旋涡混合器上混匀15分钟 ，然后根据 鲎试剂标示灵敏度(λ)，制成 2λ、λ、0.5λ和0.25λ4个 浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上 混匀30秒钟。
示例 某待复核的鲎试剂的灵敏度标示值为0.25EU/ml， 细菌内毒素工作标准品规格为150EU/ml，将细菌内毒素工 作标准品用1ml检查用水溶解，再稀释制备成浓度为 0.50EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml，和0.0625EU/ml的细 菌内毒素标准溶液。
试验中所用的器皿，需要经过处理，除去 可能存在的外源性内毒素。常用的方法是 250℃干烤至少30分钟，达到规定时间后， 关断电源，待烤箱温度自然降至室温，一 般约需6～8 小时。 也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰 细菌内毒素的检查。
除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内 使用，否则须再次除去可能存在的外源性 内毒素。
细菌内毒素检查
主要内容
细菌内毒素检查相关理论及概念
细菌内毒素 实验原理 实验试剂 实验器具
细菌内毒素检查法及注意事项
供试品溶液的制备 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数（MVD）的确定 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验 凝胶限度试验
细菌内毒素
➢ 细菌内毒素主要存在于革兰阴性菌细胞壁 的最外层，当细菌死亡、裂解后才释放出 来。
鲎试剂灵敏度复核
0.2ml 1.8ml
0.3ml 1.95ml
0.5ml 1.5ml
150EU/ml
15EU/ml
2.0EU/ml
0.5EU/ml
1.2ml 1.2ml
1.2ml 1.2ml
0.6ml 0.6ml
0.25EU/ml
0.125EU/ml
0.0625EU/ml
细菌内毒素标准溶液的制备
加样
式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶 液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml ，当L以EU/mg 或EU/U表示时，则C的单位为 mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原 料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释 浓度c= λ /L， λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 （EU/ml）。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
实验试剂
鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中
提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而 成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低 有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml 当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生可能影响检 验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
，可在此浓度下进行正式干扰试验
5、当供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素
与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释 倍数（不得超过MVD=CL/λ0.03）或通过其他适宜的方法 （如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
干扰试验
正式干扰试验
制备内毒素标准对照液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水 稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ
细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提
取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作 标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。
细菌内毒素工作标准品 系以细菌内毒素国
家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂 灵敏度复核、干扰实验及各种阳性对照。
细菌内毒素检查用水 指内毒素含量小于
0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml(用于光度测 定法)且对内毒素实验无干扰作用的灭菌注射用水。
。
制备含内毒素的供试品溶液
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数 ，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4 个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品 溶液。
加样
0.1ml内毒素标准 液
0.1ml检查用水
2λ λ 0.5λ 0.25λ 阴性对照
0.1ml含内毒素的 供试品液
0.1ml供试品液
2λ
鲎试剂灵敏度复核
λ
0.5 λ
0.轻轻混匀， 避免产生气泡，垂直放入细菌内毒素检查 专用干式恒温仪中，在37℃±1℃保温60分 钟±2分钟后，观察并记录结果。
结果观察
阳性
阴性
计算
试验结果中，如最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度 0.25λ 管均为阴性，阴性对照均为阴性，按下式计算反应终点浓度 的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。
目的 考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人
员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可 能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度 复核试验。
1、取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶 壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用 75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
2λ λ 0.5λ 0.25λ 阴性对照
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避 免产生气泡，放入37±1°C恒温器中，保温 60±2分钟，观察并记录结果
试验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性， 阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的 内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用 供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的 几何平均值（Et）
例 制备稀释倍数为4的供试品阳性对照溶液
0.3ml4.0λEU/ml的内毒素标准溶液+0.3ml稀释倍数为 2的供试品稀释液=0.6ml含2λEU/ml内毒素标准液 的稀释倍数为4的供试品稀释液。
3、保温60±2分钟，观察并记录结果。
阴性
阳性
供试品
供试品阳性
4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验有效。当 系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2 管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释 倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行 正式干扰试验。
需建立内毒素检查项目的品种
➢ 质量标准中有家兔热原检查法需转换为细 菌内毒素检查方法的品种。
➢ 用于注射给药，但未有热原质量控制的品 种。
➢ 注射用新药需建立热原质量控制的品种。 ➢ 用于静脉给药的原辅料
建立方法时对鲎试剂及样品的要求
同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 每个品种至少三批样品（上市品种应检测两 个以上生产厂家；新药需检测连续生产的 样品）。
M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或（kg·h）表示，依据 药品使用说明书，《临床用药须知》确定。
最大有效稀释倍数
最大有效稀释倍数（MVD）指在实验中供试
品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释 倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
MVD=CL/λ
细菌内毒素检查法
定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革 兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供 试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的 一种方法。
检查方法概述
凝胶法
限量试验 半定量试验
光度测定法
浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法）
凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典 的“仲裁”方法
结果判断 当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ) 时，方可
用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的 灵敏度。
干扰试验
目的 确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对
内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否 使用细菌内毒素检查法提供依据。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内 毒素检查项的品种建立内毒素检查法时， 须进行干扰试验。
举例 某注射液限值为2.5EU/ml，按MVD=CL/λ计算出灵敏度为 0.03EU/ml下的MVD为83倍，将供试品溶液进行一系列稀 释，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂预试验结果如下
稀释倍数 原液 5 10 20 40 80 供试品溶液 — — — — — — — — — — — — 供试品阳性对照— — — — — — + + + + + + 由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍
实验基本流程图
供试品
限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验 结果判断
供试品干扰实验
内毒素限值的确定
内毒素限值 L=K/M
每小时静注入人体内，不引起热原反应的最大内 毒素剂量（阈值），以EU/ml、EU/mg 或EU/U （活性单位）表示；
K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量, 以EU/ （kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h），放 射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂 K=0.2EU/（kg·h）。
BET的目的和前提
确保药品不含有能导致患者发热反应发生的 足量的细菌内毒素。
前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是 内毒素。
一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是 SFDA允许的。
细菌内毒素参考品的建立
不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同， 为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种 内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。
供试品溶液的制备
➢ 某些供试品需进行复溶、稀释或在水溶性 溶液中浸提制成供试品溶液。