• carboxypeptidase (羧肽酶法)
Phe Glu
~~~~Leu-Glu-Phe-COOH
leu
Reaction time (hour) 12
2. 二硫键的拆开和肽链的分离
• 一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨 基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质 由几条肽链构成。
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以胰岛素为例，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用 来治疗糖尿病。最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级 结构.
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二、蛋白质序列的测定步骤
测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大 于97％）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是： 1. 拆开肽链内部的二硫键。（β-巯基乙醇、二硫苏糖醇） 2. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。 3. 将每条肽链分开，并分离提纯。可用8mol/L尿素或6mol/L盐
→
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3. 肽链的部分水解和肽段的分离
（1）部分酸水解：限制水解时间、酸强度、水解温度 （2）用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。
水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。 （3）酶水解 • 胰蛋白酶（trypsin）:它专门水解赖氨酸和精氨酸的
羧基形成的肽键，所以生成的肽段的C末端是赖氨酸或 精氨酸。 • 糜蛋白酶:水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基 的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。
③ 羧肽酶法更常用： • 将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定
时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根 据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸 的排列顺序。 • 羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键， 羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。
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Amount of Amino Acid residue (mol/l)
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6. 肽链的完全水解和氨基酸组成的测定
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• 胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶：前者水解疏水残基之间的肽键， 后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。
• 金葡菌蛋白酶：又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨 酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键。在醋酸缓冲液中只水解 谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。
• 梭状芽孢杆菌蛋白酶：水解精氨酸羧基形成的肽键。
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• ② 丹磺酰氯法比DNFB法灵敏100倍。 • 丹磺酰氯是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它
能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生 成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层 析法鉴定出N-端是何种氨基酸。
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• ③ 异硫氰酸苯酯(PITC)法 • 又叫 Edman降解法。此法在pH9．0的碱性环境下，将异硫
• 必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肽链的 氨基酸顺序。
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• 如果这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他 变性剂处理蛋白质，把肽链分开。
• 如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧 化或还原的方法将二硫键拆开。如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。
• 二硫键拆开后形成的不同肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳 等方法进行分离。
第一套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS 第二套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS
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测序过程中常用方法：
1. 末端分析 （1）N末端测定 • ① 二硝基氟苯(DNFB)法---Sanger法 • DNFB在弱碱性溶液中与肽链末端自由氨基反应，生成黄色的
二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），酸水解后生成DNP-AA和 其它氨基酸混合物，再用色谱分析鉴定氨基酸种类。
第五节 蛋白质的共价结构
蛋
一级结构
共价结构
白
二级结构
质 的
超二级结构
高级结构
结
结构域
空间构象
构
三级结构
层
四级结构
次
1
一 蛋白质一级结构的概念
蛋白质的一级结构----是指蛋白质肽链中氨基酸的组成及排 列顺序。 一级结构的主要化学键是肽键，有些还包括二硫键（-S-S-） 。因共价键的键能大，故蛋白质的一级结构稳定性较强。 蛋白质的一级结构是最基本的结构，它决定着蛋白质高级结 构。
的氨基酸顺序，利用不同肽段的AA顺序彼此间的交错重叠， 拼凑出整条多肽链的AA顺序。 9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。
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氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS EOVE RLA HOWT
第二套肽段
SEO WTOU VERL
APS HO
末端残基 H
S
末端肽段 HOWT
APS
酸胍处理，即可分开多肽链。
4. 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和 比例。
4
二、蛋白质序列的测定步骤
5. 肽链的另一部分样品进行末端鉴定。（二硝基氟苯法 （FDNB）测N端；肼解法测C端。）
6. 肽链降解成一套大小不等的肽段，将各个肽段分离并测序。 7. 再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段。 8. 用Edman降解等方法测定各肽段氨基酸顺序，比较两套肽段
4、肽段的氨基酸序列测定---主要采用Edman降解法
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•异硫氰酸苯酯(PITC)法
5、肽段在多肽链中次序的推断
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS EOVE RLA HOWT
第二套肽段
SEO WTOU VERL
APS HO
末端残基 H
S
末端肽段 HOWT
APS
Hale Waihona Puke 第一套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS 第二套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS
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PITC
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测序过程中常用方法： （2）C末端测定 • ① C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。
肽链水解后，再用层析法鉴定。 • ② 肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有
的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的 酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。
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氰酸苯酯(PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，生成相 应的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH –AA），最后以色谱法鉴定 出降解下来的PTH-AA种类，从而得到蛋白质或多肽N端序 列信息。 • 优点：是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回 收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。 • 特点：从N-端依次对氨基酸进行鉴定。