蛋白质浓度测定—Bradford法
一、实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。

二、实验原理
考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250
的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大
吸收峰改变为595nm。

考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合
比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。

（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标
准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，
再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支
三、操作方法
1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
标准蛋白
含量( g)
0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0
标准蛋白
溶液
（0.1mg/
mL）(mL)
0．1 0．2 0．3 待测蛋白
质溶液
(mL)
2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.
3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
考马斯亮
蓝试剂
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

2. 未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。

根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

四、实验结果
1．标准曲线的绘制
2．蛋白浓度的计算
鸡血清稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.421
羊血清稀释200倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.500
肝匀浆稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.360
再将各所得OD值代入以下公式计算:
蛋白质含量(mg/mL)=(96.28﹡OD﹣9.1704)( μg)﹡稀释倍数/100(μL)
求得各样品浓度如下:
鸡血清=31.36 mg/mL
羊血清=77.94 mg/mL
肝匀浆=25.49 mg/mL
五、注意事项
1．如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。

2．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。

测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。