改良lowry法的原理图
650nm
• 紫外分光光度法
• 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基 酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm 处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。
• 在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也 有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除 核酸的影响 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
制备标准曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度
• 紫外分光光度法
取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度 计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值，根据 经验公式计算蛋白浓度
蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
实验仪器
实验讨论和注意事项
• 比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于标准曲线 的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影 响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液管的操作， 保证标准样品配置的准确。
• 对于分光光度计的使用要正确掌握，注意调节波长。正确 的进行仪器的调试和测定，保证结果的准确。
波长 260
280
实验步骤
• 改良Lowry法
编号 1
2
3
4
5
6
测定管
蛋白含量 17.5 35
70
105 140 0
ug/ml
未知
标准溶液、 1.0 1.0
1.0
1.0
1.0
-
1.0
样品
ml
生理盐水 -
-
-
-
-
1.0
-
ml
试剂A
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
ml
混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却
试剂B 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 ml
室温放置10分钟 试剂C 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 ml 立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色
制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度
改良Lowry法蛋白质浓度测定
蛋白浓度的测定
实验目的
• 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、 实验步骤
• 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法 测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。
实验原理
• 改良Lowry法
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜 复合物。（双缩脲反应 ） 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸 -磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋 白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关 系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）
• Coomassie亮蓝法
管 号1
2
3
4
5
6
蛋白质含 量ug/ml 标准溶液 ml 生理盐水 ml 样品 ml 染液 ml
500 0.1 － － 5
250 0.1 － － 5
125 0.1 － － 5
62.5 31.25 0
0.1
0.1
－
－
－
0.1
－－－Fra bibliotek55
5
测定管 未知 － － 0.1 5
摇匀，室温静置3分钟，以第六管为对照，于595nm波长比 色，读取吸光度。