响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华（东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０）摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。
关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５收稿日期：２００７－１０－１８作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。
主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。
（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。
（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。
在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。
织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。
现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。
（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。
（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。
现在蛋白酶的生产日趋火热。
响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。
为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。
１材料与方法１．１菌种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。
１．２培养基斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
种子培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、自然ｐＨ值。
摇瓶发酵培养基：玉米粉２％、酵母膏１％、氯化钠０．２％。
１．３试剂Ｌ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ（酪氨酸） Ｓｉｇｍａ公司；干酪素 上海润捷化学试剂有限公司；去离子水；其他药品均为国产分析纯。
１．４仪器与设备ＰＨＳ－２５型ｐＨ计 上海雷磁仪器厂；ｈｉｍａｃ ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机 日本日立公司；７２２Ｓ型紫外可见分光光度计、旋转式恒温调速培养箱、超净工作台、水浴锅。
１．５方法１．５．１粗酶液制备取活化好的斜面菌种（３４℃培养１８～２４ｈ），用接种环刮下菌种，将其转入到种子培养基，３４℃，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡２４ｈ，以５％的接种量转接于发酵培养基（５０ｍｌ发酵液／２５０ｍｌ三角瓶）中３７℃，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养６５ｈ。
将发酵液在４０００ｒ／ｍｉｎ的冷冻离心机中离心１０ｍｉｎ，得上清液即为粗酶液。
１．５．２蛋白酶活性测定采用Ｆｏｌｉｎ－酚法［７］，１ｍｌ稀释一定倍数的粗酶液加２ｍｌ质量分数为０．５％的酪蛋白液，在ｐＨ值７．０，３７℃水浴１５ｍｉｎ，再用质量分数为１０％的三氯乙酸灭活；然后取１ｍｌ上述反应液的离心上清液，加１ｍｌ Ｆｏｌｉｎ－酚在５ｍｌ０．５５ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＣＯ３的碱性条件下３７℃水浴１５ｍｉｎ，测６５０ｎｍ下的吸光度，以加灭活酶液的反应系统为空白。
在此反应条件下定义：每１ｍｉｎ生成１μｇ酪氨酸所需酶量定义为一个酶活（ＩＵ）。
１．５．３发酵条件筛选实验１．５．３．１温度对发酵产酶活力的影响考察不同温度对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定３１、３４、３７、４０、４３、４６℃六个水平。
选取ｐＨ７．５、接种量１０％、发酵４８ｈ，按照１．５．１的方法进行培养和制取粗酶液，以１．５．２的方法测定酶活，以蛋白酶活力高低作为评价指标，进行温度的四水平试验。
１．５．３．２ｐＨ值对发酵产酶活力的影响考察不同ｐＨ值对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定ｐＨ６、６．５、７、７．５、８、８．５六个水平。
选取温度４０℃、接种量１０％、发酵４８ｈ，测定方法同上。
１．５．３．３接种量对发酵产酶活力的影响考察不同接种量对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定接种量２％、４％、６％、８％、１０％、１２％六个水平。
选取温度４０℃、ｐＨ８、发酵４８ｈ，测定方法同上。
１．５．３．４发酵时间对发酵产酶活力的影响考察不同发酵时间对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定从２４ ｈ后每隔４ｈ测定一次酶活。
１．５．３．５响应面试验设计根据单因素结果，利用响应面分析法（ＲＳＭ）对温度、ｐＨ值、接种量三个因素为自变量，每个因素取三水平，以－１、０、１编码，以蛋白酶活力（ＩＵ）为响应值，进行试验设计，所有实验重复３次，每次３个平行。
如表１所示，采用ＭＩＮＩＴＡＢ１４软件进行数据处理。
图１ 温度对发酵产酶活力的影响曲线Fig.1 Effects curve of temperature on activity of produced protease １２０１００８０６０４０２００３１３４３７４０４３４６蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）发酵温度（℃）２结果与分析２．１温度对发酵产酶活力的影响图１表明，温度从３１℃变化到４０℃，蛋白酶活力逐渐升高，增加趋势明显。
随温度升至４０～４６℃，酶活逐渐下降，一方面由于酶的耐热性差，变性失活；另一方面是由于菌种在高温时大部分已死亡。
综合考虑确定发酵温度为４０℃。
２．２ｐＨ值对发酵产酶活力的影响表１ 因素水平编码表Table 1 Coding table of factors and levers因素水平－１０１Ａ 温度（℃）３７４０４３Ｂ ｐＨ７．５８８．５Ｃ 接种量（％）６８１０图２ pH值对发酵产酶活力的影响曲线Fig.2 Effects curve of pH value on activity of produced protease ２００１５０１００５００６６．５７７．５８８．５蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）ｐＨ图３ 接种量对发酵产酶活力的影响曲线Fig.3 Effects curve of inoculation amount on activity of producedprotease２５０２００１５０１００５００２４６８１０１２蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）接种量（％）图２表明，ｐＨ值在６～７．５之间，酶活增长缓慢，在７．５～８之间酶活增长较明显，ｐＨ值再升高酶活逐渐下降，所以确定发酵ｐＨ值为８，说明该菌所产的酶偏碱性。
２．３接种量对发酵产酶活力的影响图４ 发酵时间对发酵产酶活力的影响Fig.4 Effects curve of fermentation time on activity of producedprotease２５０２００１５０１００５００２４２８３２３６４０４４４８５２５６６０６４６８７２蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）发酵时间（ｈ）从图４可以看出，发酵时间在２４～４８ｈ时酶活在逐渐增长，说明这时的菌体数在不断地积累；发酵时间在５２～６０ｈ时酶活增长趋于平缓，其５６ｈ为最高，这时菌体生长处于稳定期；发酵时间的再延长菌体生长进入衰亡期，酶活也开始下降，综合考虑确定发酵时间为５６ｈ。
由于酶活在５６ｈ左右波动不大，所以不选此因素做响应面优化试验，以下实验的发酵时间都为５６ｈ。
２．５响应面优化分析如表２所示，实验点共有２０个。
可分为两类：一是１４个析因点；二是零点，为区域的中心点。
零点实验重复６次，以估计误差。
利用ＭＩＮＩＴＡＢ１４ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ程序对上面数据进行二表２ 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test变异来源系数自由度ｔ值ｐ显著性模型－２１０８８９－８．９５０．０００＊ ＊Ａ５１９１６．４３０．０００＊ ＊Ｂ２６５４１４．７００．００１＊Ｃ６８．５１１．１００．２９８–Ａ２－６．８０１－７．１６０．０００＊ ＊Ｂ２－１７６１－５．１６０．０００＊ ＊Ｃ２－７．７２１－３．６１０．００５＊ＡＢ２．９７１０．８９０．３９５–ＡＣ０．１３８１０．１６０．８７２–ＢＣ６．７７１１．３５０．２０６–表３ 回归系数显著性分析Table 3 Significance analysis of regression coefficients 注：＊．在ｐ＜０．０１水平显著；＊＊．在ｐ＜０．００１水平显著。