实验五 微生物数量的测定
林标声
实验五 微生物数量的测定
一、实验目的
1、明确血球计数板计数的原理 2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术
二、实验原理
镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮 如有杂菌或杂质常不易分辨。 液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌 或霉菌泡子可采用血球计数板 一般细菌则采用彼得 血球计数板； 或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得 罗夫·霍泽 霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板 细菌计数板。 罗夫 霍泽 细菌计数板 的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄， 的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用 油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜， 油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细 菌不易看清。 菌不易看清。
25个中方格的计数板
1mL菌液中的总菌数 =A/5*25*104*B
三、实验器材
啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板， 载玻片，电吹风，盖玻片，接种环，0.1%、 载玻片，电吹风，盖玻片，接种环，0.1%、 0.05%吕氏美蓝染色液。 0.05%吕氏美蓝染色液。
四、实验方法和步骤
1、菌悬液的制备 为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度 以每小格内含5 10个酵母宜，可采用10倍系列 以每小格内含5-10个酵母宜，可采用10倍系列 稀释法。 2、镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。如 有污物，则需清洗，用点吹风吹干后才能进行 计数。
二、实验原理
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有 条槽 而构成3个平台 中间的平台较宽， 个平台。 而构成 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分 隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。 隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共 大格， 又称为计数室)常被用作微生物 分9大格，其中间的一大格 又称为计数室 常被用作微生物 大格 其中间的一大格(又称为计数室 的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中 的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为 个中 方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大 方格，而每个中方格又分成 个小方格； 个小方格 方格分成25个中方格 而每个中方格又分成16个小方格 个中方格， 个小方格。 方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点， 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点， 即每个大方格都由400个小方格组成 个小方格组成。 即每个大方格都由 个小方格组成。
二、实验原理
每一个大方格边长为1mm， ， 每一个大方格边长为 每一个大方格的面积为1 每一个大方格的面积为 mm2，
盖上盖玻片后， 盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之 间的高度为0.1mm，所以计数室的 间的高度为 ， 容积为0.1mm3（10-4） 容积为
16个中方格的计数板
1mL菌液中的总菌数 =A/4*16*104*B
七、下一个实验
实验六 实验七 糖发酵实验 药物敏感试验
3、加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片， 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴 管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。 作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。样品要均 匀充满计数室，不可有气泡。 匀充满计数室，不可有气泡。 4、显微镜计数 加样后静止5min 然后将血球计数板置于显微镜载物台上， 5min， 加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上， 先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜（ 先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜（40 进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则， 倍）进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则，不 容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的酵母菌， 容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的酵母菌， 可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下 查上不查下， 可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不 查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2 1/2时 查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时，即可 计作两个细胞。 计作两个细胞。
5、出芽率的测定 按前法，测定出酵母菌芽体数（小于母细 胞1/2的），计算出单位体积内测得酵母菌 1/2的），计算出单位体积内测得酵母菌细胞的芽体占总数的百分率，即为酵母菌 的出芽率。
6、酵母死亡率的测定 滴一滴0.1%、0.05%吕氏美蓝液于载玻片中央 吕氏美蓝液于载玻片中央， 滴一滴0.1%、0.05%吕氏美蓝液于载玻片中央，再 用接种环取酵母菌液少许，与染液混匀，染色2 用接种环取酵母菌液少许，与染液混匀，染色2– 3min，加盖玻片，立即镜检，计数在一个视野中， 3min，加盖玻片，立即镜检，计数在一个视野中， 以变蓝（ 和未变蓝（ 的细胞数。 以变蓝（死）和未变蓝（活）的细胞数。依法再 计数2 个视野中的细胞数。 计数2-3个视野中的细胞数。 死细胞数 死亡率= 死亡率= ×100% 细胞总数 死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的 百分率。 百分率。
7、计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干 净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或 电吹风吹干。
五、实验结果
次数 中方格序号 细胞数 芽体数 细胞数/ml 细胞数 芽体数/ml 芽体数 出芽率 1 2 平均值
六、思考题
根据你的实验体会，说明用血球计数板进 根据你的实验体会， 行微生物计数时，其误差来自哪些方面？ 行微生物计数时，其误差来自哪些方面？ 如何避免？ 如何避免？