拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。
从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。
菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。
利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。
关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM—BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene．Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。
但植物的抗逆应答是一系列相关基因连续表达调控的极其复杂的调控网络。
在整个调控网络中，转录因子能调控多个相关基因的表达，所以增强转录因子的调控是提高植物抗逆性更有效的方法Ⅲ。
MYB转录因子是拟南芥中最大的基因家族。
该基因家族主要在植物的生长发育方面发挥重要作用，如植物次级代谢、信号传导、器官形成等方面[3]。
另外，也有一部分参与了逆境胁迫介导的细胞应答[4 ]。
大量研究证实，一些MYB转录因子的过量表达可以显著增加植物对逆境的耐受性L7 ]。
MYB61转录因子具有DNA结合结构域和转录调节结构域，其功能相当广泛，参与重金属、低磷和干旱等胁迫的信号调节，植物重金属胁迫与氧化胁迫是相关的【9]。
AtMYB61基因在植物中过量表达，有利于进一步研究A MyB61基因的抗逆分子机理。
因此，本文利用RT-PCR 克隆AtMYB61基因，并构建了pCAMBIA2301一At—MYB61植物表达载体，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究AtMYB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 植物材料哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株，由美国拟南芥种质资源库提供，后由本实验室繁衍，贮存。
1．1．2 主要试剂限制性内切酶Eco91I(BstEII)为Fermentas公司产品；TransTaq Polymerase High Fidelity(HiFi)为北京全式金产品；DNA凝胶纯化试剂盒、T4DNA连接酶及氨苄青霉素(进口分装)为大连宝生物公司产品；First-Strand cDNA Synthesis Kit购自上海申能博彩生物科技公司；EZ-10 Spin ColumnPlasmid Mini-Preps Kit购自BIO BASIC公司。
其它试剂均为分析纯。
1．1．3 菌株和质粒大肠杆菌DH5a由本实验室保存，农杆菌C58为中国科学技术大学提供；pUCm-T载体和pCAMBIA2301载体均为本实验室保存。
1．2 方法1．2．1 拟南芥幼苗的培养用0．1％的HgC12溶液浸泡种子3 min，去掉HgC12溶液，再用无菌水冲洗5次。
然后将拟南芥种子点种于MS固体培养基上，置于4^C冰箱中春化2 d后，转置于光照强度为100~nol／(m2·s)、22／18。
C、16／8 h光周期条件下培养14 d。
1．2．2 常规分子克隆实验技术电泳、DNA切胶回收、酶切、大肠杆菌和农杆菌感受态制备、转化、质粒提取等操作方法参见文献[1O]。
1．2．3 拟南芥AtM ，B6l基因的克隆采用Trizol法提取拟南芥幼苗总RNA。
拟南芥cDNA合成以拟南芥幼苗总RNA为模板，采用First-Strand cDNA Synthesis Kit使用说明合成cDNA。
拟南芥AtMYB61基因cDNA 的PCR扩增所用引物是根据GenBank中A￡ 61基因mRNA序列，用Primer Premier 5．0软件设计，并在上游和下游引物的5 端分别加入Bgl 1I、BstE1I酚切位点和2个保护碱基。
上游引物：5'-GA AGATCTATGC~GAGACATTCTTGCTGTT-3 ；下游引物：5'-CGC~gTCACCCTAAAGGGACTGACCA-3 。
以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 rain，94℃变性30 S，54℃退火30 S，72℃延伸90 S，共3O个循环，72℃延伸10 min，4。
C终止反应。
PCR产物经1 9／6琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化。
拟南芥AtMYB61基因TA克隆与鉴定。
将回收纯化的A￡MYB61基因DNA，用T4 DNA链接酶与pUCm-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有100 txg／mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆。
挑取单菌落在装有1 mL的LB和1．5 mL的20／,g／mL Amp离心管中37℃下培养8～10 h。
取50 培养物，煮沸5 min，5 000 r／rain，离心2 min后，取1～2 L上清进行PCR检测。
菌落PCR 验证后的菌液抽提质粒，用双酶切(BstEU和BglII)切下目的条带，电泳检测，并回收纯化。
将经抽提质粒双酶切(BstEⅡ和BglⅡ)并做PCR鉴定后的阳性克隆菌落摇菌，菌液送至上海生物工程公司测序。
1．2．4 植物表达载体的构建(1)植物表达载体pCAMBIA2301和A￡一MYB61基因的重组。
提取AtMYB61一pUCH卜T载体，并用BstEⅡ和BglII完全双酶切切下目的基因片段，电泳检测并回收纯化。
pCMBIA2301载体用BstEII完全酶切，电泳检测并回收目标载体片段，此载体片段再用BglII部分酶切，检测并回收目标载体片段。
将该载体片段与目的基因片段用T4 DNA连接酶连接。
(2)重组表达载体导人农杆菌。
用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kV／em；电容25 F；电阻500 Q。
电击3～5 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至1．5 mL的EP管中，在28℃震荡培养3 h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培养24 h，即可长出阳性克隆。
(3)阳性pCAMBIA2301一AtMYB61克隆的菌落PCR与酶切鉴定。
随机挑取单菌落，在装有1 mL 的LB和1．5 mL的抗生素的离心管中28℃培养12 h左右。
取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 r／rain离心2 min，取1～2／,L上清进行PCR扩增后电泳检测。
选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。
2 结果与分析2．1 A YB61基因cDNA的PCR扩增提取拟南芥幼苗总RNA，用高保真反转录酶反转录成cDNA，再用高保真DNA聚合酶扩增A 61基因片段。
实验中所获得的目的片段与预期大小一致，CDS+酶切位点1 114 bp，两端具有相应的酶切位点，如图1所示。
2000 bp1 000 bp750 bp500bp250 bplo0 bp图1 AtMYB61基因cDNA克隆2．2 A￡MyB61基因TA克隆与鉴定目的基因与pUCm-T载体连接并将连接产物纯化，用热击法导人大肠杆菌DH5a感受态细胞中，用含100~g／mL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性单克隆。