好食脉孢菌固态发酵脱脂葵花籽粕制备抗氧化活性肽的研究王殿友;任健【摘要】利用好食脉孢菌对脱脂葵花籽粕进行固态发酵生产具有较高活性的抗氧化肽,从而提高葵花籽粕的利用价值.对影响固态发酵的培养基组成及发酵条件进行了研究.确定最佳培养基条件为:脱脂葵花籽粕2 g,麸皮2.5g,料水比1∶2.5,pH 7.5,MgSO4加量0.02 g;较佳的发酵条件为:接种量1.0×106个/g,发酵时间5d,发酵温度30℃.在最佳条件下,发酵产物蛋白质溶出率为27.2％,抗氧化活性为186.37 U/mL.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2014(039)010【总页数】4页(P30-33)【关键词】好食脉孢菌;脱脂葵花籽粕;固态发酵;抗氧化活性【作者】王殿友;任健【作者单位】齐齐哈尔市质量技术监督检验所,黑龙江齐齐哈尔161000;齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】TS229;TQ936.2有关微生物发酵生产抗氧化活性肽国内外均有报道。
刘明等[1-2]研究了Jb009固态发酵大豆生产抗氧化活性肽的菌种筛选与活性分析，产物抑制邻苯三酚自氧化能力为23.61 U/mL。
Zhu等[3]利用枯草芽孢杆菌发酵豆渣，发酵产物具有较强的自由基清除能力。
Ren等[4]研究了黑曲霉发酵大豆的产物——腐乳的抗氧化活性，产物自由基清除能力为50%。
而利用好食脉孢菌生产抗氧化活性肽的研究较少。
好食脉孢菌可以在脱脂葵花籽粕上生长，选择合适的培养基组成和培养条件，可以有效地提高好食脉孢菌的生长水平和产酶水平，已知其酶系为复合酶系，主要由纤维素酶、糖化酶、蛋白酶组成[5]，脱脂葵花籽粕经复合酶系作用后，可以被水解成相对分子质量更小的蛋白质或短肽，并产生抗氧化活性物质。
本研究主要利用好食脉孢菌对脱脂葵花籽粕进行固态发酵以改善其溶解性，产生抗氧化活性物质，从而提高葵花籽粕的利用价值。
1 材料与方法1.1 实验材料脱脂葵花籽粕，自制。
好食脉孢菌，齐齐哈尔大学生物工程实验室分离。
硫酸镁、酒石酸钾钠、葡萄糖、三羟基氨基甲烷、焦性没食子酸等为分析纯。
1.2 实验方法1.2.1 菌种活化、接种和发酵配制PDA斜面培养基(土豆100 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g、水500 mL)，分装到试管中，灭菌之后倒斜面，接种好食脉孢菌，放培养箱中28℃活化 2～3 d。
配制固态培养基(脱脂葵花籽粕、麸皮、水、MgSO4)，灭菌，另准备无菌水20 mL。
将活化的好食脉孢菌稀释到无菌水中，用计数板计数，接种一定量好食脉孢菌到固态培养基上，放培养箱中在一定温度下发酵培养一定时间。
1.2.2 发酵产物分析(1)发酵产物蛋白质含量测定：发酵产物用50 mL 蒸馏水浸提4 h，采用Folin-酚法测定发酵产物浸提液中的可溶性蛋白含量。
采用凯氏定氮法测定脱脂葵花籽粕中的蛋白质含量。
将发酵产物浸提液中的可溶性蛋白含量折算成蛋白质溶出率(如下公式)，可以更直观地分析底物蛋白被利用的情况。
蛋白质溶出率=可溶性蛋白含量×浸提液体积×1 000/脱脂葵花籽粕中蛋白质质量×100%(2)发酵产物抗氧化活性的测定：根据文献[6-7]的方法，在试管中按表1加入Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水，于25℃恒温20 min后加入邻苯三酚(对照管用0.01 mL 10 mmol/L的HCl溶液代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm处测定吸光度A，平均自氧化速率应控制在(0.070±0.002)A/min(通过控制邻苯三酚加入量控制吸光度变化)。
样品抗氧化活性测定方法与测定邻苯三酚自氧化速率相同。
根据待测样品抗氧化活性可适当增减样品的加入量，使抗氧化活性物质抑制邻苯三酚自氧化速率控制在0.035 A/min左右。
发酵产物抗氧化活性计算公式如下：抗氧化活性反应液总体积表1 样品抗氧化活性测定条件试剂对照管/mL样品管/mLpH 8.2,50 mmol/L Tris-HCl4.54.510 mmol/L HCl0.01-样品溶液-0.01(可调整加入量)45 mmol/L邻苯三酚-0.012 结果与讨论2.1 培养基条件优化2.1.1 麸皮量对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、料水比1∶2.5、pH 7.0、MgSO4 加量0.02 g、接种量1.5×106个/g、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下，考察不同麸皮量对发酵产物的影响，结果如图1所示。
图1 麸皮量对发酵产物的影响由图1可知，固态培养基中麸皮量对发酵产物蛋白质溶出率和抗氧化活性影响很大，抗氧化活性与蛋白质溶出率之间没有直接关系，在麸皮量为2.5 g时，蛋白质溶出率为26.5%，抗氧化活性达到最高值174.6 U/mL，之后都减小。
这说明脱脂葵花籽粕与麸皮量要保持适当的比例才有利于好食脉孢菌发酵产生蛋白酶，而麸皮量过多，菌体倾向于产生其他酶系。
因此，适宜的麸皮量为2.5 g。
2.1.2 料水比对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2 g、pH 7.0、MgSO4加量0.02 g、接种量1.5×106个/g、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下，考察不同料水比对发酵产物的影响，结果如图2所示。
由图2可知，料水比对菌体利用底物的影响很大。
固态基质的含水量可影响微生物生长所要求的渗透压，在固态发酵中，含水量对微生物生长和产酶的影响是由于引起了固态基质的物理性质变化。
麸皮所含的营养成分较为丰富，麸皮中过高的含水量影响麸皮颗粒之间的松散性，真菌菌丝在生长过程中使麸皮结块，从而影响氧的传递和发酵热的散失，不利于微生物的生长；而含水量过低会影响固态基质的溶解和传递以及颗粒的润涨等，使微生物在生长和产酶过程中对营养基质的利用率降低。
料水比1∶2.0时，发酵产物的抗氧化活性与蛋白质溶出率均最高。
因此，料水比为1∶2.0较为适宜。
图2 料水比对发酵产物的影响2.1.3 pH对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2 g、料水比1∶2.5、MgSO4 加量0.02 g、接种量1.5×106个/g、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下，考察不同pH 对发酵产物的影响，结果如图3所示。
图3 pH对发酵产物的影响由图3可知，pH对发酵产物蛋白质溶出率和抗氧化活性影响较大，过酸或过碱都不利于好食脉孢菌发酵。
pH不仅影响细胞膜所带的电荷，从而引起细胞对营养物质的吸收状况的变化，而且可以通过改变培养基中有机化合物的离子化作用程度，对细胞产生间接影响，改变某些化合物分子进入细胞的状况，促进或抑制微生物的生长。
当pH为7.5时，发酵产物的抗氧化活性与蛋白质溶出率均最高。
因此，pH在7.5较好。
2.1.4 MgSO4加量对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2 g、料水比1∶2.5、pH 7.0、接种量1.5×106个/g、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下，考察不同MgSO4加量对发酵产物的影响，结果如图4所示。
由图4可知，添加少量MgSO4对发酵有一定的影响，但是影响不大。
MgSO4加量为0.02 g时，发酵产物抗氧化活性与蛋白质溶出率均较高。
因此，MgSO4加量0.02 g为宜。
图4 MgSO4加量对发酵产物的影响2.1.5 正交实验以麸皮量、料水比、pH为影响因素，以发酵产物抗氧化活性为指标，在脱脂葵花籽粕2 g、MgSO4加量0.02 g、接种量1.5×106/g、发酵温度28℃、发酵时间5 d的条件下，设计正交实验。
正交实验因素水平见表2，正交实验方案及结果见表3。
表2 正交实验因素水平水平A麸皮量/gB料水比CpH12.01∶2.07.022.51∶2.57.533.01∶3.08.0表3 正交实验方案及结果实验号ABC抗氧化活性/(U/mL)1111098.892122163.263133092.384212168.865223173.576231150. 627313147.258321157.899332124.05k1118.18138.33135.80k2164.35164.91 152.06k3143.06122.35137.73R046.17042.56016.26由表3可知，影响脱脂葵花籽粕发酵的3个因素主次关系为A>B>C，即麸皮量影响最大，因为麸皮在发酵过程中是很重要的碳源，其次是料水比，最后是pH。
本实验目的是选择改善葵花籽粕发酵产物抗氧化活性的固态培养基，因此取最佳水平组合A2B2C2，最终确定的固态培养基为：脱脂葵花籽粕2 g，麸皮2.5 g，料水比1∶2.5，pH 7.5，MgSO4加量0.02 g。
2.2 发酵条件优化2.2.1 接种量对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2.5 g、料水比1∶2.5、pH 7.5、MgSO4加量0.02 g、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下，考察不同接种量对发酵产物的影响，结果如图5所示。
图5 接种量对发酵产物的影响由图5可知，接种量在1.0×106个/g时，发酵产物的抗氧化活性达到最大值，蛋白质溶出率较高，之后随着接种量的增加蛋白质溶出率增加不大，但抗氧化活性却明显降低；而接种量太少会导致微生物生长太慢，蛋白质溶出率过低。
因此，接种量为1.0×106个/g较适宜。
2.2.2 发酵时间对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2.5 g、料水比1∶2.5、pH 7.5、MgSO4加量0.02 g、接种量1.0×106个/g、发酵温度28℃的条件下，考察不同发酵时间对发酵产物的影响，结果如图6所示。
图6 发酵时间对发酵产物的影响由图6可知，发酵时间对发酵产物蛋白质溶出率、抗氧化活性影响较大，蛋白质溶出率随发酵时间延长而增大，而抗氧化活性在发酵5 d时达到最大值187.6U/mL。
从发酵过程看，发酵3 d左右可见白色菌丝，此时蛋白质溶出率几乎没有变化，4 d左右脱脂葵花籽粕表面布满白色菌丝，局部可见橘黄色孢子，5 d时整个三角瓶长满了橘黄色的孢子，此时蛋白质溶出率较大。
因此，综合考虑蛋白质溶出率和抗氧化活性，发酵时间为5 d比较适宜。
2.2.3 发酵温度对发酵产物的影响在脱脂葵花籽粕2 g、麸皮2.5 g、料水比1∶2.5、pH 7.5、MgSO4加量0.02 g、接种量1.0×106个/g、发酵时间5 d的条件下，考察不同发酵温度对发酵产物的影响，结果如图7所示。
图7 发酵温度对发酵产物的影响由图7可知，发酵温度为30℃时，发酵产物的抗氧化活性最高，蛋白质溶出率也达到最大值。