肝细胞性肝癌中MAZ基因的表达及意义刘伟;罗伟;朱小年;贝春华;谭盛葵;侯巧燕;仇小强【摘要】目的探讨MAZ基因在肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)及其癌旁正常组织中的表达,分析其与HCC各临床病理特征及预后的关系.方法采用组织芯片技术和免疫组化法检测75例HCC及其对应癌旁正常组织中MAZ基因的表达,分析其与HCC临床病理特征及与患者预后的关系.结果 MAZ在HCC中的表达(48％,36/75)明显高于其癌旁正常组织(22.67％,17/75),组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).MAZ表达与HCC患者性别、年龄、病理分级、临床分期、TNM分期、是否合并肝硬化、是否合并乙肝病毒感染、是否有肝癌家族史以及血清AFP、CEA、γ-GT、ALT、AST和ALB水平、是否有淋巴结转移等均无明显相关性,而与肿瘤直径、吸烟与否、饮酒与否显著相关(P＜0.05).HCC中MAZ阳性组和阴性组的累计生存率差异有显著性(P＜0.05),MAZ阳性组患者的术后无瘤生存时间明显低于阴性组,提示MAZ表达上调可能导致患者的预后更差.结论 MAZ基因表达上调可能与HCC的发生、发展密切相关.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(032)006【总页数】5页(P606-610)【关键词】肝肿瘤;肝细胞性肝癌;MAZ;免疫组织化学;预后【作者】刘伟;罗伟;朱小年;贝春华;谭盛葵;侯巧燕;仇小强【作者单位】桂林医学院附属医院肝胆外科,桂林541004;桂林医学院附属医院肝胆外科,桂林541004;桂林医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室,桂林541004;桂林医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室,桂林541004;桂林医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室,桂林541004;桂林医学院附属医院病理科,桂林541004;广西医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室,南宁530000【正文语种】中文【中图分类】R735.7MAZ(Myc-associated Zinc-finger protein)即MYC相关的锌指蛋白，在人体各组织器官中广泛表达，其编码基因位于人常染色体16p11.2，其转录产物为2.7 kb的mRNA，编码477个氨基酸而得到一个相对分子质量约为6.0×104的MAZ蛋白[1,2]。
近年来的研究发现，MAZ异常表达与人类恶性肿瘤的发生、发展关系密切。
已有相关文献报道证实，MAZ蛋白在一些基因的启动转录过程中发挥重要的调节作用，如癌基因中的核蛋白类调控基因c-myc[3]、RAG-2[4]和过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ1[5]等，同时MAZ蛋白也在某些基因的终止转录过程发挥着重要作用，如Sp4[6]、端粒酶[7,8]等。
因此，MAZ是一个在启动某些基因转录和终止靶基因转录的过程中发挥着双重调控作用的转录因子。
目前MAZ基因在肝癌中的表达及其在肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生、发展过程中的作用机制尚未见专题报道。
本文应用组织芯片技术以及免疫组化法检测MAZ在HCC及其癌旁组织中的表达，分析其与HCC临床病理特征的关系，以及MAZ在HCC中不同的表达量与患者预后的关系，以探索MAZ基因在肝癌发生、发展过程中的作用机制，为寻找肝癌早期诊断的分子标志物及分子靶向治疗的有效靶标提供参考。
1.1 临床资料本实验所有涉及的人体标本的获取均征得患者及其家属同意，并通过医院伦理委员会批准。
收集桂林医学院附属医院病理科2005～2014年存档的HCC及相应的癌旁组织标本各75例(共150个组织位点)，临床和病理均诊断为HCC，选取的癌旁正常组织距癌灶距离>3 cm。
所有患者均在该院行手术治疗，术前均未行放、化疗，且均有完整的临床资料：其中男性61例，女性14例，年龄17～79岁，平均49.8岁，肿瘤直径≥5 cm者49例，直径<5 cm者26例；肿瘤组织学按Edmondson-Steiner病理分级标准分类：Ⅰ+Ⅱ级54例，Ⅲ级21例；吸烟情况：有吸烟史者32例，无吸烟史者32例，其中11例未记录；13例有区域及远处淋巴结转移，62例未见淋巴结转移。
1.2 试剂与方法由桂林泛谱公司将石蜡组织标本制成组织芯片，包含HCC和癌旁正常组织的有效组织共有150个组织位点，采用免疫组化SP法检测MAZ的表达。
组织芯片置于60 ℃烘箱中烘烤2 h，室温冷却后二甲苯脱蜡40 min，接着梯度乙醇水化，后于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中高压(198.325 Kpa)修复抗原3 min，山羊血清封闭工作液(购自北京中杉金桥公司)封闭1 h，后甩干勿洗，滴加MAZ一抗(美国Abcam公司，工作浓度1 ∶200)，摇匀保证组织覆盖均匀，4 ℃冰箱过夜；第2天用PBS缓冲液冲洗，然后甩干，浸泡于3%过氧化氢溶液中10 min；再用PBS缓冲液冲洗，滴加即用型羊抗兔二抗(购自福州迈新公司)，室温下孵育15 min；后用DAB显色试剂盒(福州迈新公司)显色，镜下观察3～10 min至阳性部位出现明显显色后终止；苏木精复染，流水返蓝10 min，无水乙醇脱水，自然风干，中性树胶封固。
全程无干片情况。
1.3 结果判定(1)400倍镜下随机选取5个不同的视野，计数细胞总数及阳性细胞数按阳性细胞所占的百分比：无阳性细胞为0分，阳性细胞数<30%为1分，30%～70%为2分，>70%为3分。
(2)根据细胞着色深度分别记分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分，着色深度以多数细胞显色程度为准。
将两项得分结果相乘：0分为(-)，1～3分为(+)，4分为()、6～9分为()。
其中总分<4分为阴性，≥4分为阳性。
1.4 统计学分析所有数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，各组间差异比较采用χ2检验，累积生存率运用GraphPad Prism 5软件绘制生存曲线以及采用Log-rank检验来比较MAZ高、低表达这两组生存曲线的差异。
P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 MAZ在HCC及其癌旁组织中的表达HCC组织中MAZ表达主要呈阳性；癌旁组织中MAZ表达主要呈阴性，其阳性表达部位主要位于细胞核和细胞质(图1)。
MAZ在HCC及其癌旁组织中的阳性率分别48.00%(36/75)、22.67%(17/75)，MAZ在HCC中表达明显高于癌旁组织，组间比较差异有统计学意义(χ2=12，P<0.05，表1)。
2.2 MAZ表达与HCC临床病理特征的关系MAZ表达与HCC患者性别、年龄、病理分级、临床分期、TNM分期、是否合并乙肝病毒感染、是否有肝癌家族史，血清AFP水平、癌胚抗原(CEA)水平、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)水平、血清ALT水平、AST水平和ALB水平以及淋巴结转移等均无明显相关性(P>0.05)，而与肿瘤直径、吸烟与否、饮酒与否等则具有相关性(P<0.05，表2)。
2.3 MAZ表达与HCC患者术后无瘤生存时间的关系将75例HCC组织分为MAZ阳性组(、)36例及阴性组(+、-)39例。
比较不同MAZ表达程度HCC患者的生存时间，从生存曲线可以观察到MAZ阳性组和阴性组的累计生存率差异明显(其中有6例失访)，经Log-rank检验分析显示，差异有统计学意义(χ2=4.491，P=0.034)。
MAZ阳性组患者的术后无瘤生存时间明显低于阴性组(图2)。
全球恶性肿瘤中HCC发病率位居第6位，病死率位居第3位。
据2012年WHO统计全球新发病例约782 500例，死亡745 500例，其中半数以上的新发和死亡病例均为中国人[1]。
肝癌的起病十分隐匿，大部分患者在发现时已经到了中晚期，患者预后差，5年生存率极低。
亦因其极高的病死率，又被称为“癌中之王”。
MAZ基因的表达产物是MYC相关锌指蛋白，其蛋白结构上在C末端有6个C2H2类型的锌指结构域，其还有一个脯氨酸丰富区和三个丙氨酸重复区。
MAZ 基因目前的研究已经分离到了一个黏粒克隆，大小约40 kb[2]。
目前很多的研究发现MAZ基因在人体中表达广泛，其亚细胞表达部位主要位于细胞核和细胞质。
有研究显示，MAZ基因异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，MAZ在前列腺癌、转移性鼻咽癌等多种恶性肿瘤中均呈异常高表达。
Zaytseva等[9]的研究发现MAZ在乳腺癌组织中表达上调，进一步研究其功能机制时发现，MAZ基因主要是参与了MCF-7乳腺癌细胞中癌基因的转录调控，当通过RNA干扰技术抑制其相关癌基因表达，或者直接通过下调MAZ基因的表达，均可达到抑制MCF-7乳腺癌细胞的增殖侵袭能力的效果。
Wang等[5]的研究结果也证实了MAZ在乳癌组织中表达上调，进一步研究其机制时发现，MAZ可以特异性地促进PPARγ1在乳腺癌细胞中的表达上调，当在正常的乳腺上皮细胞中转染MAZ 基因后，可引起PPARγ1的表达上调，进而促进乳腺癌的发生。
本组实验采用组织芯片技术和免疫组化法对75例HCC组织及其癌旁正常组织中MAZ的表达进行检测，结果显示：MAZ在HCC组织中的阳性率为48.00% (36/75)，而在相应的癌旁组织中的阳性率仅为22.67%(17/75)，MAZ在HCC中的表达明显高于其毗邻的癌旁正常组织，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
实验结果支持了MAZ在恶性肿瘤中高表达的结论，提示MAZ表达上调可能与肝癌的发生、发展密切相关。
众所周知，c-myc基因是MYC基因家族的重要成员之一，c-myc基因是目前研究最为深入且与肝癌发生最为紧密的原癌基因之一，在多种肿瘤的形成过程中处于重要地位。
在转基因模型中，Shachaf 等[10]发现转基因小鼠可以模拟人类的一些分子病理过程，在小鼠肝细胞中条件性地表达c-myc原癌基因，可以引起小鼠发生肝肿瘤，而抑制其表达则可使肝肿瘤逆转并进入重新分化和休眠状态并伴有肿瘤细胞的凋亡，一旦恢复c-myc的表达，又会引起肿瘤再度生长。
c-myc基因的启动转录受到2个启动子—P1和P2的控制，其中大部分是由P2启动转录的，然而P2启动子在启动c-myc基因转录时需要有3个因素的参与：ME1a2、ME1a1和E2F，MAZ蛋白作为一个转录因子，它能够结合到原癌基因c-myc的ME1a1位点上的GA盒(GGGAGGG)，也可以与c-myc基因的第一外显子的P2衰减子区域结合，还可以和终止c-myc基因转录的补体2(C2)的相关序列结合[11]。
有学者研究发现一些来源于神经外胚层的P19细胞，一定要有MAZ的参与，才能启动由ME1a1介导的c-myc基因的表达。