分泌表达: pel/ompT分泌肽
按启动子分：
lac及衍生的tac, trc, pac, rac等启动子 lamda phage PL和PR 启动子 T7 启动子 T5 启动子 ara启动子
IPTG诱导 热诱导 IPTG诱导 IPTG诱导 阿拉伯糖诱导
酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与 蛋白质分离纯化
基因表达体系
Escherichia coli
• E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命 名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆 菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918 年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和 BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质
基因表达体系
原核体系
✓ 大肠杆菌 (Escherichia coli)
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰
✓ 枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳 定，尚无商品化的表达载体
✓ 昆虫细胞
可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜 蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限
✓ 哺乳动物细胞/组织
可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高
✓ 植物细胞/组织
植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不便
细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广 泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外 源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白， 在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏
His·tag S·Tag
目标蛋白
Trx·tag thrombin enterokinase
表达载体包括的成分
（１）复制起始点 （２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因） （３）强的、可诱导的启动子 （４）强的转录终止序列 （５）核糖体结合位点 （６）合适的多克隆位点
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基因表达体系
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分：
单纯表达: 如pJLA系列 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc
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基因表达体系
基因的融合
• 采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达 系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型 多功能蛋白
• 构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实 现两个基因的融合表达
✓ 其它
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
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基因表达体系
真核体系
✓ 酵母细胞
可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表 达;商品化表达体系：酿酒酵母、毕氏酵母、裂殖酵母 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高
基因表达体系
常用表达载体
pET系列 pQE系列 pMAL系列 pGEX系列 pBAD系列 pTYB系列
(T7 promoter, Novagen公司) (T5 promoter, Qiagen公司) (周质表达, BioLabs公司) (GST融合表达, Pharmacia公司) (Arabinose诱导型) (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
• 由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常 用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在《Journal of Molecular Biology》 (2009)
• 基因组大小4.6M bp
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基因表达体系
目标蛋白质在大肠杆菌中的表达
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基因表达体系
体系选择
✓ 研究基因功能
大肠杆菌、裂殖酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
✓ 多肽药物生产
大肠杆菌、毕氏酵母、哺乳动物细胞组织
✓ 疫苗
大肠杆菌、酵母、动植物细胞组织
✓ 单抗生产
杂交瘤细胞
✓ 工业酶生产
各种微生物
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硫氧还蛋白标签
凝血酶
肠激酶
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蛋白质分离纯化
基因表达体系
载体分类
• 克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体 • 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达
元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的 载体
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基因表达体系
酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与 蛋白质分离纯化
第四讲 基因表达与蛋白质分离纯化
酶与蛋白质工程-第源表达的关键问题就是发展克隆基因的 表达方法，即找到理想的宿主表达系统
目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达 系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系 统各有优缺点
酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与 蛋白质分离纯化
酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与 蛋白质分离纯化
基因表达体系
利用融合技术表达外源基因原因：
• 为蛋白质的表达和纯化提供方便 • 蛋白质结构和功能的研究 • 获得蛋白质的途径（通过体外切割） • 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 • 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 • 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 • 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST • 蛋白表达的空间定位：信号肽