3、4. 解吸附阶段：用梯度缓 冲溶液洗脱，先洗下弱吸附 物质，后洗下强吸附物质
原始缓 冲溶液 的反离 子
5.再生阶段： 用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用
30.06.2020
样品溶液
梯度浓度
27
30.06.2020
28
应用
制备、纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
30.06.2020
32
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、
sepharose、sephadex
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
30.06.2020
33
聚焦层析（Chromatofocusing） 原理
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其 分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行 为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过 程叫做聚焦效应。
30.06.2020
42
（三）按支持介质形状不同 1.薄层电泳 ； 2.板电泳 ； 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为： 1.分析电泳； 2.制备电泳； 3.定量免疫电泳；
30.06.2020
43
（五）按所用电压不同可分为： 1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适
于分离蛋白质等生物大分子。 2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有
电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。
4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯
度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集
成很窄的区带。
30.06.2020
41
（二）按支持介质的不同可分为： 1.纸电泳 2.醋酸纤维薄膜电泳 3.琼脂凝胶电泳 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
30.06.2020
16
30.06.2020
17
分配层析(p148)
原理：
分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种 以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离 的方法
分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸 层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机 溶剂为流动相（展开剂）。
30.06.2020
18
样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
30.06.2020
9
(二) 层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物
质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可
以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶
29
亲和层析（affiuity chromatography）
原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体) 以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其 中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形 成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解 离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。
SDS- PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
30.06.2020
4
一透 析
定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。
操作
蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂 （如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、 单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于 袋中而得到分离。
30.06.2020
30.06.2020
23
分类： 根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，
阳离子交换剂; 阴离子交换剂； 按其解离度的大小， 分为强、中强、弱三种：
30.06.2020
24
阳
离 子 交 换
离 子 交 换 剂
强酸型 中等酸型 弱酸型
结合磺酸基团（ SO3H） 磷酸基团（ PO3H2）和亚磷酸基团（ PO2H） 结合酚羟基（ OH ）或羧基（ COOH）
30.06.2020
39
电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电 极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少 取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各 组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性 质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用 下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组 分的目的。
30.06.2020
35
1、pH梯度的形成 2、蛋白质行为 3、聚焦效应
30.06.2020
36
流速
移动速率
蛋白质1（pI=7）
蛋白质2（pI=8）
pH梯度溶液的形成示意图
30.06.2020
层析时的聚焦效应示意图
37
几种主要层析方法比较
30.06.2020
38
二 、 电泳技术
电泳的一般原理 电泳技术的分类 电泳的影响因素 常用电泳技术
30.06.2020
20
原理p303
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质
进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性
的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体
网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子
大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个
组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散
程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
30.06.2020
3、琼脂糖电泳
4、毛细管电泳
30.06.2020
48
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
凝胶聚合反应及催化系统 不连续PAGE 可产生的三种效应：
电荷效应、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE ），是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙 烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉 双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚 合过程需要有自由基催化完成。
各类层析的原理和载体
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
30.06.2020
基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离
Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离
载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
30.06.2020
19
凝胶层析（gel filtration）
又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、 凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
5
透析工作图
30.06.2020
半透膜原理
6
30.06.2020
7
二 层析技术（chromatography） p148
一、层析技术一般原理
二、层析技术分类及应用
30.06.2020
8
（一）、层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
30.06.2020
2
沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
30.06.2020
3
纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
30.06.2020
40
电泳分类
• （一）按原理分四种
• 1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。
2.自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家
Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无
支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。
3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各
层 阴 强碱型
季胺基团（ N(CH3)3），
析 分
离 子
中等碱型叔胺（
N(CH3)2）、仲胺（
NHCH3）、伯胺（-N
类 交 弱碱型
二乙基氨基乙基（DEAE）
换
剂
30.06.2020
25
30.06.2020
26
交换过程
1
2
3
4
5
1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离子进行交换
液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆
的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果
起着关键的作用。
30.06.2020