・述评・电泳技术的现状和发展沈霞 早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学物理化学系Svedberg教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳(electrophoresis)。

于1937年,由Arne T iselius教授———诺贝尔奖金获得者,利用此电泳现象,发明了最早期的界面电泳(m oving boundary),用于蛋白质分离的研究,开创了电泳技术的新纪元。

此后,各种电泳技术及仪器相继问世,先进的电泳仪和电泳技术的不断发展,使它在生物化学实验技术中占重要地位,按电泳的原理有三种形式的电泳分离系统:原则上按电泳的原理来分,即移动界面电泳(m oving boundary electrophoresis)、区带电泳(zone electrophoresis)和稳态电泳(steady state electrophoresis)或称置换(排代)电泳(dis2 placement electrophoresis)。

在自由移动界面电泳,是带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定,该方法已成为历史。

代之以采用支持介质的区带电泳。

区带电泳因所用支持体的种类、粒度大小和电泳方式等不同,其临床应用的价值也各有差异。

固体支持介质可分为两类:一类是滤纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等;另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。

由于它们具微细的多孔网状结构,故除能产生电泳作用外,还有分子筛效应,小分子会比大分子跑得快而使分辨率提高。

它的最大优点是几乎不吸附蛋白质,因此电泳无拖尾的现象。

低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳,蛋白质在电场中可自由穿透,阻力小,分离清晰,透明度高,能透过200～700nm波长的光线,故电泳结束后无须进行“透明”,可减少操作步骤及由此引起的实验误差,又因底板无色泽,也提高了对着色区带的检测敏感性,为此第一类支持介质现已被第二类支持介质所替代。

稳态电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态,如等电聚焦和等速电泳。

区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术,有重要临床意义,尤其是结合了其他新技术,更扩大了其应用范围,提高了检测技术,现对该技术的现状与发展作一评述。

一、正确解释电泳结果,有助于临床疾病判断的参考新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌,一般常见的是白蛋白降低,某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。

如急性炎症时,可见α1,α2区百分率升高;肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降,α2球蛋白升高,β球蛋白也升高;缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高,而慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显著降低,γ球蛋白升高2～3倍,示免疫球蛋白多克隆增高,甚至可见β2γ融合的桥连现象,还可在γ区呈现细而密的寡克隆区带;对单一克隆浆细胞异常增殖所产生的无抗体活性的均一的免疫球蛋白称M蛋白(m onoclonal protein)的检测,血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。

可在电泳区带的α～γ区呈现致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生区带,称其为M蛋白区带,扫描后形成高而狭窄的单株2峰,若此峰在γ区其峰高与峰底宽之比>2∶1,且由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色浅。

由M蛋白所导致的一组疾病如:多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等,目前这类疾病已不属罕见。

血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断,疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。

二、电泳技术与免疫技术相结合,大大扩大了其临床应用的范围让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向,从而加快了沉淀反应的速度。

免疫电泳技术的种类很多,如:对流免疫电泳(CIEP)、火箭免疫电泳(RIE)、电免疫扩散(EI D)。

在原有的几种免疫电泳方法的基础上,又不断地派生出一些新的技术,如:免疫电泳(IEP)技术,1969年Alper与Johns on推荐免疫固定电泳作者单位:200092上海第二医科大学附属新华医院检验科(IFE)是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作,是免疫沉淀反应的一种混合技术,检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其他体液。

1976年血清免疫固定电泳(IF)技术再次被推荐,用于M蛋白的分型。

血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后,应用固定剂和各型免疫球蛋白及其轻链抗血清,加于凝胶表面的泳道上,经孵育让固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散后,若有对应的抗原存在,则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。

电泳凝胶在洗脱液中漂洗,以除去未结合的蛋白质,仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。

经染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色,根据电泳移动距离分离出单克隆组分,可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。

该技术的最大优势是敏感性达50～150mg/dl,操作周期短,仅需数小时,分辨率高,结果易于分析。

现最常用于M蛋白的分型与鉴定,已列入临床实验室的常规检测工作。

三、电泳技术进行同工酶谱分析,提高诊断率11血清乳酸脱氢酶同工酶(is o2LDH):测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法,但迄今用得最多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。

经电泳分离后可分离出五种同工酶区带,急性心肌梗塞发病后平均6h LDH1即开始升高,LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平,肝癌时可见LDH5明显升高,各区带含量的确定,将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量,其精确度明显高于用肉眼判断。

21血清肌酸激酶同工酶(IS O2CK):测定CK和CK2M B仍是目前用于证实急性心肌梗塞的首选指标。

近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK2M B,其原理为抗M亚单位的抗血清可以和CK2M M及CK2M B中的M 亚单位形成抗原抗体复合物,从而完全抑制M亚单位的酶活性,因为正常血清中几乎无CK2BB,故将此值乘以2可以认为大致代表CK2M B的活性。

此法简单迅速,缺点是特异性差,如患者血清中存在CK2BB或者异常CK时,都将出现假性增高。

不少作者报道异常CK2同工酶,一条称巨CK(Macro2CK),它是CK2BB与免疫球蛋白的复合物,有IgG亦有IgA,在正常血清中Marco2CK仅占0.8%～1.6%。

另一条称线粒体2CK(CK2 MT),CK2MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面,可能是线粒体膜的碎片,在正常血清中CK2MT是不出现的,在心梗时亦不出现,只有当组织极度损伤,由于线粒体和细胞壁极度破坏,方可在血清中检出。

由于Macro2CK和不典型的CK2MT均不能被M抗体所抑制,故当它们出现时,会导致CK2M B高于CK总活力的假性升高。

使用电泳方法分离CK2M B,是根据CK2同工酶分子结构不同,在电泳缓冲液中,所带电荷各异,可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离,其分别为CK2M M,CK2M B和CK2BB。

电泳特点是当出现异常同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等,从电泳图谱上很容易发现,由扫描仪对各条酶谱进行扫描,报告各条区带所占百分比,结合总酶活力,求得区带的酶活力定值结果。

Macro2CK在CK2M M和CK2M B中间,而CK2MT位置靠近阴极端,在CK2M M后面。

这样不会将CK2BB和各种异常同工酶误认为是CK2M B而误诊,也可解决CK2M B假性增高的错误原因所在。

为此,CK同工酶电泳是一项非常实用的检验技术,具有十分重要的临床意义。

31CK亚型同工酶:此外,CK2M B和CK2M M亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳,由于操作比一般电泳麻烦,故常规测定尚无法普及。

目前引进的自动电泳仪,有试剂盒提供,可作CK亚型分析,参考值:CK2M M1为(57.7±4.7)%;CK2M M2为(26.5±5.3)%;CK2M M3为(15.8±2.5)%;CK2M M3/CK2M M1比值为0.28±0.05(范围0.15～0.39),阳性决定性水平>0.5。

AMI第一天血中以M M3为主,但第二天以后则以M M1为主。

采用电泳法分离CK M B,CK M B1和CK M B2在正常人血中CK2M B2极微,一般比值近似1,在急性心肌梗塞后4～6h CK M B2亚型即在血循环中可被检测到,故M B2/M B1的比例明显升高,并早于总CK2 M B片段的增高。

当心肌梗塞缓解后此比例也逐渐下降。

也可用于溶栓治疗后的病情观察。

四、结合酶免疫标记抗体技术,检测脑脊液内寡克隆区带曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定,方法繁复,耗时。

现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质,并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”(OC B),经此酶免疫标记放大技术和显色步骤,蛋白质浓度达31～125μg/L即可予以检测,可使检测灵敏度提高了100倍,这样脑脊液无须浓缩,避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。

可用于证实和分辨OC B免疫球蛋白及其型别。

若在脑脊液标本中检出OC B,而其相应血标本中未能检出区带,则为阳性,真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白,具有重要临床意义。

它是一种定性检测,在多发性硬化症时,OC B是一个十分重要的标志物。

但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析,以论证不同来源的免疫球蛋白。

中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用于诊断和鉴别诊断中枢神经系统疾患如:多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅毒等。

五、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白(a),用于心、脑血管独立的危险因子的检测该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。

血清经琼脂糖凝胶电泳,再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。

由于凝胶中脂蛋白等电点不同,不仅可区分α、前β和β区带,又因介质中含有抗脂蛋白(a)[LP(a)]抗体及阳离子存在,抗LP(a)抗体与患者血清中LP(a)结合形成复合物,阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其他脂蛋白分离开来。

使分辨十分清晰的LP(a)条带呈现在前β与γ区域之间,将阳性条带扫描后,可获得区带的面积及其百分含量,该方法使电泳技术趋于完美,大大减少了手工操作的弊端,既可予以半定量,又能将胶片保存,便于比较。

提高对心、脑血管独立的危险因子———LP(a)检测的敏感性和特异性。

六、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳,区分尿蛋白类型尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型,可在无损伤的情况下,协助临床判断肾脏损伤的部位。

国内部分实验室采用S DS2PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离,该法具有局限性,耗时,操作繁琐,标本要求高,尿液需预浓缩,不适于临床实验室广泛开展。