表1 稀释度选择及菌落总数报告方式
实例
1 2 3 4 5 6 7
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2
10-3
1365
164
20
2760
295
46
2890
271
60
150
30
8
多不可计
1650
513
27
11
5
多不可计
305
12
两个稀释度 菌落总数/ 菌落数之比 （CFU/mL）
报告方式 /(CFU/mL)
③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例5）。
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的
平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例6）。
⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间， 则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数 报告之（见表1实例7）。
6.菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要 时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落 数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计 算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个 平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以 无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。 若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数 分布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全 皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1， 0.01mL甚至0.1， 0.01，0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接 种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种， 每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。
接种管置36 ℃+1 ℃培养箱内，培养24h+2h后,如所有乳糖蛋白胨培 养管都不产酸产气，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则 按下列步骤进行。
能的，除非管网中有充足的营养物质(生化需氧量(BOD)超过 10mg／L)或者不合适的物质接触到处理后的水，水温超过 15℃，以及管网中没有游离余氯。
❖ 从这些参数的含义可以知道他们的可能联系是，在硝酸盐氮, 氨氮,耗氧量较高时，水体污染程度较大，其相应的卫生指标 总大肠菌群,耐热大肠菌群也比较高，这主要是针对生活污水 而言的，因此这种关系在其他类废水中不一定存在。
❖ 如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热 大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌污 染时，可直接多管耐热大肠菌群方法，即在 第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群接种乳 糖蛋白胨培养液在44.5 ℃ +0.5 ℃水浴中培 养。
6.结果报告
❖ 根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最 可能数（MPN）检索表，报告每100mL水样 中耐热大肠菌群的最可能值。
二、总大肠菌群
❖ 1.方法——多管发酵法（另有滤膜法和酶底物法） ❖ 2.定义
总大肠菌群（total coliforms）指一群在37℃培养 24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。
❖ 3.主要培养基：乳糖蛋白胨培养液、伊红美兰培
养基和革兰氏染液。
❖ 4.主要仪器：培养箱、平皿和试管等。
—— 1.6 2.2 2 —— —— ——
16400 37750 27100 1500 513000 270 30500
16000或1.6×104 38000或3.8×104 27000或2.7×104 1500或1.5×103 510000或5.1×105 270或2.7×102 31000或3.1×104
2011年 农村饮用水水质微生物
检测技术
微生物指标
❖ 菌落总数 ❖ 总大肠菌群 ❖ 耐热大肠菌群
一、菌落总数
❖ 1.方法——平皿计数法 ❖ 2.定义:
菌落总数（standard plate-count bacteria）水 样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得 1mL水样所含细菌的总数。
5.检验步骤
❖ ①乳糖发酵试验
取1mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种 到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入9mL灭菌生理盐水 中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养 液中，每一稀释度接种5管。
对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接 种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。
⑥若所以稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出 报告之。
⑦如果所以平板上都菌落密布，不要用“多不可计” 报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2 个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平 均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍 数作报告。
⑧菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报 告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效 数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短 数字后面的零数也可用10的指数来表示。
表2 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组 合时的最可能数（MPN）
5个10mL管中阳性管数 0 1 2 3 4 5
Hale Waihona Puke 最可能数（MPN） ＜2.2 2.2 5.1 9.2 16.0 ＞16
三、耐热大肠菌群
❖ 1.方法——多管发酵法（另有滤膜法） ❖ 2.定义
耐热大肠菌群（thermotolerant coliform bacteria）用提高培养温度的方 法将自然环境汇中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5 ℃仍 能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。
❖ 生活饮用水
1mL水样+15mL45℃左右琼脂
摇匀，
做平行样和空白对照。冷却后，翻转平板， 36 ℃+1 ℃培养48h后计数。
❖ 水源水
先制成1：10，1：100等稀释液，再按生 活饮用水的检验步骤进行检验。
注意事项
❖ （1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培 养基。
❖ （2）吸液体时液体不能进入吸头。 ❖ （3）样品稀释时一定要混匀。 ❖ （4）倒培养基前，瓶口要过火焰。 ❖ （5）一定要有空白对照。 ❖ （6）培养基温度控制，培养基薄厚。
6.结果报告
❖ 查表
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查 MPN（most probable number,最可能数）检 索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最 可能数（MPN）值。5管法结果见表2,15管结 果见表3.稀释样品查表后所得结果应乘稀释 倍数。如所有乳糖发酵管均为阴性时，可报 告总大肠菌群未检出。（表3略）
厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其 生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并 不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
❖ 3.主要培养基：营养琼脂 ❖ 4.主要仪器：培养箱36 ℃+1 ℃等
5.检验步骤
❖ 分离培养
将产酸产气的发酵管分别转钟在伊红美兰琼脂 平板上，于36 ℃+1 ℃培养箱内培养18h～24h，观 察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰染色、 镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落
❖ 证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆 菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36 ℃+1 ℃培养箱内培养24 h+2h,有产酸产气者，即 证实有总大肠菌群存在。
❖ 耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分．将培养温度提高到 44～45℃，在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群被称为耐 热大肠菌群。它们由埃希氏菌属以及克雷伯菌属、肠杆菌属
和柠檬酸杆菌属中的一些菌种组成。这些生物中．只有埃希
氏大肠杆菌是粪源特异性的，就是指通常大量存在于人类、
其它哺乳动物和鸟类粪便中，很少在不是粪便污染主体的土 壤和水中发现． 耐热大肠菌群在供水系统中再繁殖是不可
耐热大肠菌群的卫生学意义
❖ 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有 粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受 到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大 肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。
❖ 通常情况下耐热大肠菌群与总大肠菌群相比，在人 和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界 容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为近期 水体直接或间接地受到了粪便污染。因而，与总大 肠菌群相比，耐热大肠菌群在水体中的检出，说明 水体更为不清洁，存在肠道致病菌和食物中毒菌的 可能性更大。
❖ 3.主要培养基：EC培养基和伊红美兰琼脂 ❖ 4.主要仪器：恒温水浴培养箱
5.检验步骤
自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产 酸产气）中取1滴转钟于EC培养基中，置 44.5 ℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴 箱的水面应高于试管中培养液面），培养24 h+2h后，如所有管均不产气，则可报告为阴 性，如有产气者，则转钟于伊红美兰琼脂平 板上，置44.5 ℃培养18h～24h，凡平板上有 典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
7.不同稀释度的选择及报告方法
①首选30～300之间进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落 数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1实例1）。
②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视 二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数 （见表1实例2），若大于或等于2则报告其中稀释度较小的 菌落数（见表1实例3、4）。