为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构 检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 • 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有 效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 • 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导 致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 • 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连 续的G） • 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
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分子信标探针
结构自由能控制在 3~5之间
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Non-T7引物
CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTT
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T7引物
TAATACGACTCACTATAGGGAGA acctatcctatttgtacatccattca
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TMA 检测技术的优势
→领先的 RNA 检测技术 TMA 技术检测病原体 RNA。一个病原体细胞内含有
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TaqMan法优缺点
优点
对目标序列的高特异性 -----阴性结果确定
设计相对简单 ------与目标序列某一区域
互补 重复性比较好
缺点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
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TMA检测技术示意图
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TMA扩增反应原理图
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技术原理
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产 生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝， 然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产 生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一 个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩 增循环；同时，带有荧光标记的探针和这 些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光 信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反 映扩增循环情况。
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探针设计原则
• 探针位置尽可能地靠近上游引物 • 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性 • 检测探针的DNA折叠和二级结构 • Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%
－70% • 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5‘G会有淬灭作用，而且即使是被切
TMA技术采用实时荧光检测，仪器自动化程度较高， 解放了操作人员，并且能够得到标准、稳定的结果。
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TMA VS REAL-TIME PCR
都采用实时荧光检测技术
TMA与PCR检测相比较灵敏度更高；特别是加入内标后，PCR检测 灵敏度下降很大
TMA检测产生的放大终产物是RNA，而PCR产生的是DNA；RNA很容易 自然降解，而DNA则较为稳定，即TMA检测在污染控制方面更为容 易
多达 个 RNA 拷贝，大大提高了检测灵敏度。 →先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行（42℃），不需要热循环。 →更高的检测灵敏度和准确性
TMA 技术的扩增效率极高，15～30分钟即可将模板扩 增 倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术 。 →有效的解决了核酸检测的污染问题
污染是核酸检测的最大问题。TMA 技术的扩增产物为 RNA ，环境中自然降解，污染少，更进一步提高检测结 果的可靠性。 →高效率的自动化检测
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TaqMan法工作原理
每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光
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TaqMan 法 PCR反应的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，20－30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为58-60℃
身形成环状发卡结构 • 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并
降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核对序列杂交， 降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 • Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40% －60% • 引物之间的TM相差避免超过2℃ • 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续 相同的碱基 • 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 • Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp • 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
割下来还会存在淬灭作用。 • 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，
这时就应选择配对的另一条链作为探针。 • 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发
现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
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引物设计原则
• 序列选取应在基因的保守区段 • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自
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总体原则
• 查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。 • 目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，
确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列 • 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 • 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因
Taqman法荧光PCR 引物探针设计
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实时荧光定量PCR TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
❖ 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ❖ 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ❖ 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 ❖ Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同