低变性温度共扩增PCR及其衍生技术的研究进展王清【摘要】低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低廉等优点.该技术及其衍生技术能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变,在肿瘤个体化诊断、无创性产前诊断、HBV基因型耐药监测等领域具有广泛的应用前景.本文对此类技术及应用进展作一综述,旨在为其临床及实验室应用提供参考.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2016(034)002【总页数】4页(P140-143)【关键词】低变性温度共扩增PCR;突变;检测【作者】王清【作者单位】福建医科大学第一临床医学院,福州350005【正文语种】中文【中图分类】R446.9目前，用于临床突变检测的分子诊断技术很多，包括Sanger 测序法、线性反向探针杂交技术(INNO-LiPA法)、限制性片断长度多态性分析等，但这些技术普遍存在灵敏度较低(一般为5%～20%)的缺点。

临床上常用的Sanger 测序法检测 HBV 耐药突变时，只有当突变型HBV比例>20%才可检出，即灵敏度仅为20%，因无法发现低比例的早期耐药突变，使慢性乙型肝炎患者无法获得及时的药物调整，最终导致病毒学和血清学发生改变[1]。

研究表明，Sanger测序法对使用拉米夫定后临床怀疑耐药却未检出突变患者的检测灵敏度较低，应选用灵敏度较高的方法，如等位基因特异性实时荧光定量PCR(RT-ARMS-qPCR)，才可检出YVDD或YIDD 突变[2-3]。

因此，研发具有高灵敏度的突变检测方法，并促进其在临床推广应用实属必要。

近年来出现的低变性温度共扩增PCR(Co-amplification at lower denaturation temperature-PCR，COLD-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，且能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变，且对突变类型和突变位置无特殊要求[4]。

相对传统PCR而言，COLD-PCR仅需调整循环条件和变性温度即可极大提高检测的灵敏度，因此具有广泛的临床应用前景。

COLD-PCR是基于杂合DNA双链存在碱基不匹配导致其稳定性下降的原理，在关键变性温度(Tc)下能选择性扩增含有突变的杂合DNA双链，而抑制纯野生型DNA双链的扩增。

该技术的关键点是Tc值的确定：首先确定产物的熔解温度(Tm)；再选定一个Tx值(Tx代表测试和调整的温度，初始Tx值一般高于Tm值1～2 ℃)，以Tx值为基础进行一系列温度递减的PCR(每次降低0.5～1 ℃)，当温度降至PCR反应不能检测到产物时，该温度的前1个温度即为Tc值。

DNA序列中单个核苷酸的改变会导致Tc值的变化，杂合DNA双链的变性温度低于纯合DNA双链；基于此，COLD-PCR通过设置Tc值为DNA的变性温度，实现从高野生型DNA模板中富集低浓度的DNA突变。

COLD-PCR分为完全COLD-PCR (full-COLD-PCR )和快速COLD-PCR(fast-COLD-PCR)，两者各有优势，前者可富集所有突变，后者只能富集Tm值下降的突变，但后者比前者操作简便，在实际应用中可根据不同的需要对两者进行选择。

COLD-PCR通过富集少量已知和未知突变，极大提高下游检测技术(高分辨率熔解曲线、Sanger测序法、TaqMan探针等)的灵敏度，实现了对少量突变的高灵敏度检测。

在此基础上，由传统COLD-PCR改良的ice-COLD-PCR(improved andcomplete enrichment COLD-PCR)及TT-COLD-PCR(Temperature-tolerant COLD-PCR)技术可实现对突变位点的多重检测，进一步体现了其在分子诊断中的应用优势。

以下对此两种技术原理及优缺点。

2.1 改良型完全富集COLD-PCR(improved and complete enrichment COLD-PCR, ice-COLD-PCR) 是基于传统COLD-PCR的ice-COLD-PCR技术，其在循环中引入一条3′去磷酸化的野生型特异性寡核苷酸参考序列(reference sequence，RS)，同时，此序列比目的扩增子稍短以确保其在循环中不扩增，在扩增的早期阶段RS与突变型扩增子形成杂合双链，在Tc循环条件下杂合双链优先变性扩增，而野生型纯合双链扩增被抑制；其热循环过程类似于完全COLD-PCR，但比后者富集能力更佳，可将突变模板比例提高至50%以上，该方法检测灵敏度达到0.1%[4-6](图1)。

Alexandre等[7]基于ice-COLD-PCR建立了E-ice-COLD-PCR(Enhanced-ice-COLD-PCR)，该方法在RS序列中引入锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)，在缩短RS序列的同时保证其高Tm值，显著提高该方法的特异性；同时该方法具有标本用量少，操作简便等优势。

2.2 温度耐受性COLD-PCR(Temperature-tolerant COLD-PCR,TT-COLD-PCR) 该技术在传统COLD-PCR基础上，对Tc值做一个2.5～3 ℃的温度梯度，在每个Tc值下完成一个COLD-PCR循环，保证一定Tm值(Tm值相差2.5～3 ℃)范围内的突变型模板优先扩增，突破了传统COLD-PCR严格的Tc值限制[Tc值在±(0.2～0.3 ℃)]，实现对所有突变模板的富集[8]。

经实验证明，此种温度耐受的条件在所有形式的COLD-PCR均能实现(full、fast、ice-COLD-PCR)，同时通过加入二甲基亚砜(DMSO)可解决Tm值范围过宽的问题。

然而，该方法相对传统COLD-PCR而言，其富集突变模板的量较少，且由于循环数的增加易形成引物二聚体以及反复的变性易使聚合酶失活而导致扩增效率的下降。

基于上述缺陷， Milbury等[9]发明了一种新型TT-fast-eCOLD-PCR(Temperature-Tolerant- fast-COLD-PCR in Emulsion)技术，其PCR反应在油水乳化液中进行，由于引物对间相互作用减弱，避免了引物二聚体的形成。

Castellanos-Rizaldos等[10]基于TT-COLD-PCR建立了多重fast-TT-COLD-PCR技术，该技术通过使用寡核酸“尾巴”经平末端连接反应连接到所有预扩增的DNA扩增子的两端，修饰后的扩增子经通用引物即可完成突变的富集。

其优势为通过在PCR反应中引入修饰的核苷酸(dITP/dDTP代替dGTP/dATP)能够富集Tm值升高的突变，富集效率与full-COLD-PCR相一致。

目前，COLD-PCR及其衍生技术与高分辨率熔解曲线(HRM)分析、TaqMan探针、Sanger测序法等下游检测技术结合在肿瘤监测、无创性产前诊断、HBV基因型耐药检测等领域得到广泛应用。

3.1 COLD-PCR在肿瘤检测中的应用肿瘤患者体内存在的少量突变的识别和检测，对肿瘤起源和进化的理解，辅助肿瘤风险的评估、治疗方案的选择和疗效的监测等方面具有重要意义[11-12]。

COLD-PCR具有高灵敏度的优势，能显著提高下游检测技术的灵敏度。

例如COLD-PCR与HRM结合，用于检测肿瘤常见突变(TP53、KRAS、IDH1等)，其灵敏度比单一HRM提高了3～6倍，比Sanger测序法提高了100倍[8, 13-15]。

由于灵敏度获得了极大的提高，从而实现了对消化道常见肿瘤的少量突变(TP53、KRAS、IDH1、EGFR、H-ras)的检测，为阐明突变在促进肿瘤发生和发展、疾病诊断、个体化治疗和肿瘤预后中的作用提供了大量的证据[2, 11, 16-20]。

KRAS基因突变与许多肿瘤密切相关，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和造血系统肿瘤等。

EGFR和KRAS突变与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)的疗效密切相关。

EGFR突变的NSCLC患者与TKIs药效呈正相关，而KRAS突变的NSCLC患者与TKIs药效呈负相关[21]。

因此，EGFR和KRAS突变的早期检测对于药物的个体化治疗具有重要价值。

研究表明，COLD-PCR能显著提高EGFR 和KRAS等突变检测的灵敏度，可用于指导抗肿瘤药物的合理利用及探讨交界性肿瘤(介于良性和恶性之间的肿瘤)与癌症之间是否具有相关性[22-24]。

抑癌基因TP53编码的蛋白质是一个多功能的转录因子，其具有调控细胞生长、凋亡和DNA修复等功能，然而突变的TP53基因却与肿瘤的形成相关。

用TT-fast-eCOLD-PCR成功实现对TP53第6到第9外显子4个突变的早期多重检测，为癌症的早期诊断提供了有力的证据[9]。

少量W515突变的早期发现，对于骨髓增生性白血病早期阶段的诊断、提供预后信息、实现风险分层及调整治疗策略具有重要价值。

COLD-PCR结合微阵列芯片技术能显著提高W515突变检测的灵敏度(0.1%)，实现半定量，并可同时对多个样本进行分析，极大的提高了突变检测效率[25]。

肿瘤患者的标本来源困难且形式多样，限制了传统PCR的应用，而COLD-PCR 有望解决这一难题。

研究表明，用COLD-PCR技术对黑色素瘤患者BRAF V600突变进行检测，结果显示该技术对3种类型标本(冰冻切片、福尔马林固定石蜡包埋的标本、血浆)均能检测，其灵敏度为0.01%，该突变的早期发现对于黑色素瘤进展阶段的及时治疗和个体化用药具有重要意义[26-28]。

在肿瘤治疗期间，对患者液体标本中少量循环DNA突变的检测，为肿瘤患者的分子特征、诊断和药效学监测方面发挥着十分重要的作用。

Richardson等[29]用ice-COLD-PCR结合二代测序、数字PCR等对液体标本中少量突变进行检测，解决了标本中循环DNA过少和标本量不足的问题。

3.2 COLD-PCR在无创性产前诊断中的应用传统的绒毛膜取样、羊膜腔穿刺术等侵入性产前诊断对母体和胎儿的安全均构成威胁。

COLD-PCR对标本类型要求不高，对于传统PCR检测不出的突变标本(如标本含量不足或背景细胞过多)，COLD-PCR更能发挥其高灵敏度的优势，可在一定程度上解决临床标本来源困难的问题[5, 30-31]。

研究表明，COLD-PCR能在高母体血清DNA的背景下检测少量游离的胎儿DNA，两者结果具有良好的一致性，为无创性产前诊断提供了新的思路[30, 32]。

应用COLD-PCR对胎儿遗传性疾病进行筛查，在降低流产风险和孕后期检查伤害方面具有重要价值[5, 30]。