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4. 穿梭载体
◆穿梭载体(shuttle vectors )是指能 在两种不同的生物中复制的载体。 例如既能在原核生物(如大肠杆菌) 中复制，又能在真核细胞(如酵母) 中复制的载体。因此，这类载体不 仅具有细菌质粒的复制原点及选择 标记基因，还有真核生物的自主复 制序列(Autonomously replicating sequence, ARS)以及选择标记性状， 具有多克隆位点。通常穿梭载体在 细菌中用于克隆、扩增克隆的基因， 在酵母菌中用于基因表达分析。
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一 基因工程概述
基因工程的内容
? 目的基因的获得 ? 目的基因与载体的连接成重
组DNA分子 ? 重组DNA分子导入受体细胞 ? 筛选重组克隆 ? 基因表达与产物分离
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一 基因工程概述
重 组
DNA
技 术
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二 限制性内切核酸酶
★限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes)是细菌中
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1. 细菌质粒
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色 体而自然存在的、能自我复制、易分 离和导入的环状双链DNA分子。 ☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。 进入宿主细胞复制后，每个细胞的质 粒拷贝数可高达1000个。 ◆早期用于基因工程的载体是经遗传 改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆 分子量小于10kb( 1000bp =1kb)的外源 DNA片段。 ☆现在广泛使用且商品化的质粒，很 多都具有重组表型检测标记，在DNA 克隆中根据宿主细胞的表型即可推知 质粒是否携带外源DNA片段。
这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制 (restriction )或阻止病毒侵染。
★限制性酶据其作用特点，可分为两类。
※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分 子，没有序列特异性。
※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶 切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的序列是对称 的，即在一条链中从5' 到3' 方向的序列，与其互补链从5' 到3' 方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列 称为回纹对称序列(palindrome)。
★具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复 制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制， ★具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每 一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些 酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内。
★至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细 胞具有易鉴别的表型。 ★易从宿主细胞中回收。
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一 基因工程概述
★从细胞和组织中分离DNA。 ★利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restriction
endonucleases)酶切DNA分子，制备DNA片段。
★将酶切的DNA片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。 ★将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后，
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3. 柯斯质粒
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◆柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌 体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建 而成的(图9－5)。柯斯质粒具有λ噬菌 体的cos序列(12bp) 和细菌质粒的复制 原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬 菌体时所必需的，而质粒的复制原点 可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细 菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具 有抗生素抗性基因 ◆可接受长达50kb的外源DNA片段， 这在克隆真核生物基因中十分有用， 因为一个DNA片段就可能具有真核生 物基因的编码序列及其它调控序列。 还与YAC克隆系统结合，用于基因作 图分析。
第八章 基因工程和基因组学
第一节 基因工程 第二节 基因组学
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第一节 基因工程
一 基因工程概述 二 限制性内切核酸酶 三 载体 四 基因的分离与鉴定 五 基因工程的应用
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一 基因工程概述
★遗传工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的遗 传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。 狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍 基因工程。 ★基因工程中的 DNA重组主要是指创造自然界中没有 的DNA分子的新组合。这种重组不同于经典遗传学中 经过遗传交换产生的重组。基因工程是采用分子生物 学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手 段建立起来的 基因操作技术。
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5. 细菌人工染色体
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建
的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在 细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程 改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。
该重组DNA分子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷 贝，即克隆(clones)。
★重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体
细胞均具有重组DNA分子的拷贝。
★能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。 ★克隆的DNA能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定
基因产物。
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2. λ噬菌体
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◆ λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬 菌体DNA中间约三分之二的序列 为中间基因簇(central gene cluster)， 位于两端的为DNA左、右臂。λ 基因组的中间基因簇序列可被外 源DNA片段取代, 而不影响噬菌 体感染细菌及形成噬菌斑的能力。 ◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为 克隆载体，也可作为表达载体， 在基因库筛选中，λ噬菌体作载体 与细菌质粒相比，具有易操作、 阳性克隆数多等特点，现广泛用 于各类基因库的构建。
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二 限制性内切核酸酶
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二 限制性内切核酸酶
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10三 载体Fra bibliotek一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组 DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主 细胞(host cell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。 可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌 人工染色体（BAC、YAC）等。 作为载体DNA分子，需要具备以下四个条件：