panbio登革热IgM 捕获ELISA法Cat No. E-DEN01M预定用途：Panbio登革热IgM 捕获ELISA法是一种定量检测血清中登革热IgM抗体的方法，可以作为临床具有登革热症状病人的临床实验室检测辅助手段。
Panbio 登革热捕获ELISA法应和其它的登革热血清学方法联合应用。
序言：登革热，黄病毒属(B群黄病毒)，广泛存在于热带和亚热带地区。
通过蚊子，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。
感染了登革热病毒在临床上可以引起一系列从不明显到致死性的登革出血热症状。
典型登革热症状表现为突然发热、激烈头痛、肌痛、关节痛和出疹。
还有二相热型、失眠、由于味觉丧失或苦味导致的厌食等也很常见。
登革出血热和登革休克综合征经常是伴随二次血清感染出现的严重并发症。
登革热病毒IgM抗体ELISA检测法是一种很有用的方法，尤其是在二次和后继的多次感染中，那时并发症的发生率很高。
登革热病人的血清IgM抗体能在发热后3~5天就能检测并通常能持续30~90天，虽然检测水平可能在感染后的8个月都可存在。
原理：IgM群血清抗体和粘附在微孔测试板聚笨乙烯表面上的抗人IgM抗体相结合。
用抗原稀释液把登革热1~4号抗原浓缩液稀释到恰当的工作容量。
抗原由昆虫细胞表达系统和一种免疫纯化的单克隆抗体制得而成。
在稀释抗原中加入适量的辣根过氧化物酶（HRP）结合单克隆抗体（MAb）形成抗原-MAb复合物。
洗去测试板内的残存血清，加入抗原-MAb复合物。
孵育后，洗涤微孔板，加入无色底物，四甲基联苯胺/过氧化氢（TMB/H2O2）。
底物被酶水解后变成蓝色。
加酸终止反应后，TMB变成黄色。
颜色的变化表明测试样本中有抗登革热IgM抗体。
提供的材料：1．抗-人IgM包埋微孔板—（测试板）微孔用抗-人IgM抗体包埋（12*8个孔）。
备用。
不用的微孔板立即收好，贮存在有干燥剂的地方。
在2-8ºC稳定至失效。
2. 登革热1-4号抗原（重组体）—一个透明有盖的玻璃瓶，150 μL（蓝色）浓缩的登革热病毒抗原1,2,3和4号。
没有用过的稀释的抗原一定要扔掉。
浓缩的抗原贮存于2~8度直至失效。
3. 洗涤缓冲浓缩液—一瓶60ml用吐温20和防腐剂（0.1% ProclinTM）20倍浓缩的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2-7.6)。
在低温下可能会形成结晶。
为避免这种情况，把它放在37ºC直至变得透明。
充分混匀。
在1份洗涤缓冲浓缩液加入19份蒸馏水稀释。
稀释的缓冲液在2~25ºC可以贮存一个星期。
4. 血清稀释液-两瓶50ml装（粉红色）。
备用。
三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(pH 7.2-7.6) 含防腐剂（0.1% Proclin）和添加剂。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
5. 抗原稀释液-一瓶50ml装（透明色）。
备用。
磷酸盐缓冲液含防腐剂（0.1% ProclinTM 和0.005% 庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
6. 辣根过氧化物酶共轭单克隆抗体示踪剂-一瓶7ml装（黄色）。
备用。
辣根过氧化物酶共轭单克隆抗体示踪剂含防腐剂（0.1% Proclin.）和蛋白稳定剂。
在2~8度保持稳定直至失效。
7. 四甲基联苯胺TMB-一瓶15ml装。
备用。
3,3,5,5'-TMB和枸酸盐缓冲液（pH 3.5-3.8）内的过氧化氢的混合物。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
8. IgM阳性对照血清-一个黑色有盖的瓶子装有200 μL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
9. IgM标准血清-一个橙色有盖瓶子装有400μL人血清（内含0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
10. IgM阴性对照血清-一个白色有盖的瓶子装有200 μL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
11. 终止液-一个瓶子15ml装。
备用。
1M磷酸。
在2~25ºC保持稳定直至失效。
Proclin. 300是Rohm and Haas公司的注册商标产品对照和标准血清安全注意事项：在这些成份里叠氮化纳的浓度是有毒性的，是属于下列级别(R22, R32)的：“吞食有毒”和“和酸接触会释放出有毒气体”另外必需具备但不提供的材料：(1) 精确可调节微量移液器（5-1000 μL容量），配备一次性使用吸管(2) 去离子水(3) 微量培养板洗涤系统(4) 酶标仪配备450nm滤波片(5) 计时器(6) 刻度量筒(7) 烧瓶(8) 血清稀释用的试管或微量滴定板(9) 抗原稀释用的玻璃或塑料试管或瓶。
警示用于体外诊断用(i)用在准备对照时的所有人类来源的材料在测试对人类缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗体时，都为阴性。
但是没有哪种方法能够完全保证，所以所有的人体对照和抗原都应该认为是潜在的感染源。
疾病预防控制中心和国家健康署建议可能传染的抗原应该在2级生物安全下进行处理。
(ii)这种测试只能用血清。
用全血、血浆或是其它的样本间质不能做。
(iii)黄疸的或黄体脂蛋白血清，或表现出溶血的，或有细菌生长的血清都不可用。
(iv) 不要加热失活的血清。
(v) 在开始实验前，所有的试剂必须要平衡至室温（20~25ºC）。
试验受到室温变化的影响。
只有达到了室温才能把微孔板从密封包里拿出来。
(vi) 用干净的枪头直接在瓶子里配试剂。
转移试剂可能会导致污染。
(vii) 未用过的微孔板，应立即重新封存，并储存有干燥剂的地方。
如果不这样做可能会造成错误的结果。
(viii) 底物系统(a) 由于TMB易受金属离子污染影响,所以不允许底物系统和金属表面接触。
(b) 避免长时间暴露于阳光直射下。
(c) 一些洗涤剂可能会干扰TMB的表现。
(d) TMB可能会有一些淡蓝色。
这个不会影响底物的活性或者试验的结果。
警告(ix)这些试剂盒成份内含有叠氮化钠，它可能与铅或铜管道反应形成高爆炸性金属叠氮化合物。
当通过水管装置来去除这些试剂时，用大量的水冲洗以防止叠氮积聚在排水管。
(x) 叠氮化钠会抑制结合物的活性。
必须用干净的移液管枪头来加结合物以致叠氮化钠不会被其它试剂携带污染。
为获得更多的安全信息请参照从PANBI0得到的原料安全数据表（MSDS）.标本收集和准备让静脉血在室温下（20~25ºC）凝结成块，然后根据全国临床实验标准委员会(NCCLS)（收集诊断静脉血的认可标准程序，H3-A4, 1998）进行离心。
血清应尽快分离并冷藏（2~8ºC），如果在两天内不试验的话，就应该冷冻（-20ºC或更低的温度）。
不推荐使用自我解冻的致冷机。
黄疸血清、有溶血的、脂血的或是有细菌生长的血清都不推荐使用。
CLSI提供贮存血样的建议。
（血样处理加工的认可标准程序，H18-A2, 1999）。
测试程序注意：确保在实验前，所有的试剂都平衡至室温（20~25ºC）。
在超出所提供的时间和温度范围内试验可能会导致无效的结果。
没有在即定的时间和温度内进行的试验应重复一次。
血清预稀释(i) 从箔袋内拿出所需数量的微孔板，并插入夹板固定器。
5个板分别是阴性对照，阳性对照和三个标准物。
确保剩下未用的微孔板紧紧地密封在箔袋内。
(ii) 用合适的试管或微量滴定板稀释阳性对照，阴性对照，标准物和病人样品。
(a) 在10μL血清中加入1000μL血清稀释液。
充分混匀。
或者(b) 在10μL血清中加入90μL血清稀释液。
取出20μL稀释的血清加入180μL血清稀释液。
充分混匀。
ELISA操作步骤方法概括参见附图(a)抗原(i) 确定好你试验所需孔的数量。
用抗原稀释液稀释抗原1/250。
建议最少要稀释10μL 抗原至2.5ml抗原稀释液。
这样才足够做5条带（共有40个孔）。
每条带都需要0.5ml稀释的抗原。
一旦抗原被加入了抗原稀释液，那溶液就会变成淡蓝色。
确保剩下没用的浓缩抗原贮存在2~8 ºC。
(ii) 取出需要量的稀释抗原，然后在一个干净的玻璃或塑料瓶里混合相同体积的MAb 示踪剂。
轻轻地混匀抗原和MAb 示踪剂溶液，再在室温下保持至所需时。
弃掉没用过的稀释抗原。
(b) 测试板(iii) 混匀后10分钟内，吸取100μL稀释的病人样本和对照，分别加入测试板相应的微孔内。
(iv) 盖上测试板，在37 ºC±1 ºC孵育1小时。
(v) 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。
（参见下面的冲洗步骤）(vi) 混匀抗原和MAb示踪剂。
吸取100 μL混匀物，加入测试板相应的孔内。
(vii) 盖上测试板，在37 ºC±1 ºC孵育1小时。
(viii) 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。
（参见下面的冲洗步骤）(ix) 在每个孔内加入100 μLTMB。
(x) 从第一次加入算起，在室温下(20-25 ºC)培育10分钟。
蓝色将会出现。
(xi) 按TMB加入的时间和顺序，在所有的孔内加入100 μL终止液。
混匀。
蓝色将会变成黄色。
(xii) 30分钟内读数，波长450nm，参照滤波器600~650nm。
注意：如果是双波长分光光度计，在600~650nm间设定参照滤波。
如果在450nm 读数没有参照滤波时，可能会由于背景因素出现更高的吸光值。
冲洗步骤：有效的冲洗能去除没有混合的样品或成分，这对于ELISA程序是很有必要。
A. 全自动冲洗板(1) 吸光所有孔内容物。
(2) 在冲洗过程中，洗涤缓冲液要注满孔（350 μL）(3) 6次冲洗完后，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
(4) 全自动冲洗板一定要维护好，确保冲洗效果。
在所有时间内都要遵照制造商的冲洗说明。
B. 人工冲洗(1) 把内容物倒入合适的废物缸。
(2) 用一个合适的挤压瓶把洗涤缓冲液加满孔，避免起泡，因为这可能会降低冲洗效果。
立即倒掉缓冲液。
(3) 重新加满，再立即倒掉。
(4) 再重复4次步骤3。
总共用洗涤缓冲液洗6次。
(5) 洗完最后一次后，倒掉孔内容物，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
质量控制：每个试剂盒包括标准物，阳性对照和阴性对照血清。
在随附的说明表列有这些血清合适值。
那阴性和阳性对照是用来监测由试剂引起的失败。
阳性对照不能确保试验临界点的精确度。
如果对照或标准的吸光度值没有达到说明书标准，则测试无效，就应该重做。
如果测试无效，病人结果就不能报告。
质量控制需要必须遵照当地的、州和/或国家法律或委任书和你们实验室标准质量程序。
建议用户参照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202(c)中的合适的质量控制实践指导。