生物化学简明教程（第四版)课后习题————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:２蛋白质化学１.用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答:（1) N-末端测定法:常采用2,4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
①2,4―二硝基氟苯(DNＦＢ或FＤNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与2,4―二硝基氟苯(2,4―DNFB）反应(Sａngeｒ反应)，生成ＤNP―多肽或DNＰ―蛋白质。
由于ＤNＦB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为黄色DNＰ―氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。
②丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Ｃl)反应生成DＮＳ―多肽或DNS―蛋白质。
由于DＮS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNS―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质ＤNＳ―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。
③苯异硫氰酸脂(ＰITＣ或Edman降解)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯(PITＣ）反应(Eｄman反应),生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。
在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。
根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。
（2)Ｃ―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
②还原法:肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。
肽链完全水解后,代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。
③羧肽酶法：是一类肽链外切酶,专一的从肽链的Ｃ―末端开始逐个降解,释放出游离的氨基酸。
被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。
根据释放的氨基酸量(摩尔数)与反应时间的关系，便可以知道该肽链的C―末端氨基酸序列。
2.测得一种血红蛋白含铁0.426%,计算其最低相对分子质量。
一种纯酶按质量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸２.４8%，问其最低相对分子质量是多少？解答:（1）血红蛋白:3.指出下面pH条件下,各蛋白质在电场中向哪个方向移动，即正极,负极，还是保持原点？(１)胃蛋白酶(pI 1.0)，在pH ５.0;(2）血清清蛋白(pI 4.9）,在pH 6.０；（3）α-脂蛋白(pＩ 5.8）,在ｐH ５.0和ｐH 9.０;解答:（1）胃蛋白酶pI １．0<环境ｐＨ5.0,带负电荷，向正极移动;（2)血清清蛋白pI 4.9<环境ｐH6．０,带负电荷，向正极移动;(３)α-脂蛋白ｐI 5.8>环境pH５.0,带正电荷，向负极移动；α-脂蛋白pI 5.8＜环境pH ９.0,带负电荷，向正极移动。
4.何谓蛋白质的变性与沉淀？二者在本质上有何区别？解答:蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后,使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变,这种作用称为蛋白质的变性。
变性的本质:分子中各种次级键断裂,使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。
蛋白质变性后的表现：① 生物学活性消失; ② 理化性质改变：溶解度下降，黏度增加,紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感,易被水解。
蛋白质由于带有电荷和水膜,因此在水溶液中形成稳定的胶体。
如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂,破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷,则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
沉淀机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。
蛋白质的沉淀可以分为两类：(1)可逆的沉淀：蛋白质的结构未发生显著的变化,除去引起沉淀的因素，蛋白质仍能溶于原来的溶剂中，并保持天然性质。
如盐析或低温下的乙醇(或丙酮）短时间作用蛋白质。
（2)不可逆沉淀:蛋白质分子内部结构发生重大改变,蛋白质变性而沉淀，不再能溶于原溶剂。
如加热引起蛋白质沉淀,与重金属或某些酸类的反应都属于此类。
蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在,并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已经变性。
5．下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中:CNBr,异硫氰酸苯酯，丹磺酰氯,脲,６mo ｌ/ＬHCl β-巯基乙醇,水合茚三酮，过甲酸,胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶,其中哪一个最适合完成以下各项任务?(1)测定小肽的氨基酸序列。
（2)鉴定肽的氨基末端残基。
（3）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。
若有二硫键存在时还需加什么试剂？（４）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。
(5）在甲硫氨酸残基羧基侧水解肽键。
（６）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。
解答：（１）异硫氰酸苯酯;(2)丹黄酰氯;(3)脲; －巯基乙醇还原二硫键;(4）胰凝乳蛋白酶；(5）CNBr;(6）胰蛋白酶。
6.由下列信息求八肽的序列。
（１)酸水解得Ａla,Aｒg,Leｕ,Met,Ｐｈe,Thｒ，2Val。
（2）Sａngeｒ试剂处理得DNP-Alａ。
(3)胰蛋白酶处理得Ala,Arｇ,Tｈr和Ｌeｕ,Met，Phe，2Ｖal。
当以Sangeｒ试剂处理时分别得到ＤNP-Ａｌa和DＮＰ-Val。
(4)溴化氰处理得Alａ,Arg,高丝氨酸内酯,Thｒ，2Val，和Lｅｕ，Pｈe，当用Sａn ｇer试剂处理时,分别得ＤＮP-Ala和DNP-Ｌeu。
解答：由(2)推出Ｎ末端为Aｌa；由（3）推出Vａl位于Ｎ端第四,Aｒg为第三,而Thr 为第二；溴化氰裂解,得出Ｎ端第六位是Met，由于第七位是Ｌeu,所以Phe为第八；由（4)，第五为Ｖal。
所以八肽为：Ａlａ-Thr－Aｒg-Vaｌ-Ｖａl-Mｅt-Leｕ-Pｈe。
７．一个α螺旋片段含有1８０个氨基酸残基,该片段中有多少圈螺旋？计算该α-螺旋片段的轴长。
解答:１８0/3.6=50圈,５0×0.５4=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为２7nm。
8.当一种四肽与FDNＢ反应后,用5.7moｌ／LHCl水解得到DＮP-Ｖal及其他3种氨基酸；当这四肽用胰蛋白酶水解时发现两种碎片段；其中一片用LｉBH4(下标）还原后再进行酸水解，水解液内有氨基乙醇和一种在浓硫酸条件下能与乙醛酸反应产生紫(红）色产物的氨基酸。
试问这四肽的一级结构是由哪几种氨基酸组成的？解答：（1）四肽与FＤNＢ反应后,用5.7ｍoｌ／LHCｌ水解得到DＮP-Val，证明N端为Ｖａl。
（2）LiBＨ4还原后再水解,水解液中有氨基乙醇,证明肽的C端为Gｌy。
（3)水解液中有在浓H2SO4条件下能与乙醛酸反应产生紫红色产物的氨基酸，说明此氨基酸为Trp。
说明C端为Gly-Trp…(4)根据胰蛋白酶的专一性,得知N端片段为Ｖaｌ-Arg(Lys)…，以(1）、(2）、(３）结果可知道四肽的顺序:N－V al－Ａｒｇ(Lys）-Trp－Gｌｙ－Ｃ。
9.概述测定蛋白质一级结构的基本步骤。
解答：（１)测定蛋白质中氨基酸组成。
（２)蛋白质的N端和Ｃ端的测定。
(３）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂,各自得到一系列大小不同的肽段。
(4)分离提纯所产生的肽,并测定出它们的序列。
（5)从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。
如果蛋白质含有一条以上的肽链,则需先拆开成单个肽链再按上述原则确定其一级结构。
如是含二硫键的蛋白质，也必须在测定其氨基酸排列顺序前，拆开二硫键，使肽链分开，并确定二硫键的位置。
拆开二硫键可用过甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成两个半胱氨磺酸。
10 Lys GｌｙVａl Ｐhe Thｒ在球状蛋白质中所处的位置,为什么?核酸2.为什么DNA不易被碱水解，而ＲＮＡ容易被碱水解?解答:因为ＲＮA的核糖上有2-OH基，在碱作用下形成2,3-环磷酸酯,继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸。
ＤＮA的脱氧核糖上无2-OH基，不能形成碱水解的中间产物,故对碱有一定抗性。
3.一个双螺旋DNA分子中有一条链的成分[Ａ］=0.30,[G] = 0.２4，①请推测这一条链上的[T]和［Ｃ]的情况。
②互补链的[A］，[G],[T]和［C]的情况。
解答：①[Ｔ] + ［C] = 1–0.3０–０.2４= 0.46；②[Ｔ] = ０．30,［C］=0.２4,[A] + [G] = ０.４6。
4.对双链DNA而言,①若一条链中(A + Ｇ）/(T +C）= 0．7,则互补链中和整个DＮA 分子中(A+Ｇ）/(T+C）分别等于多少?②若一条链中（A + T)/(Ｇ+ C）＝０.7，则互补链中和整个DNＡ分子中(A+ T)／（G+ C）分别等于多少?解答:①设DNA的两条链分别为α和β则: Aα= Tβ，Tα=Aβ，Gα＝Ｃβ，Cα= Gβ，因为：（Aα＋Gα)/(Tα+ Cα）= (Tβ+ Cβ）/（Aβ+Gβ)＝0.7，所以互补链中(Aβ+ Gβ）／（Tβ＋Ｃβ)= １/０.７=１．43;在整个ＤNＡ分子中,因为A ＝T, G =Ｃ,所以，Ａ＋G= T + C,(A+ Ｇ）/（T+Ｃ)=1;②假设同（1)，则Aα+Tα= Tβ+ Aβ，Gα+ Cα＝Ｃβ+ Gβ，所以,(Aα+ Tα）／（Gα+Cα）=(Aβ+ Ｔβ）/(Ｇβ＋Ｃβ）=0.7 ;在整个ＤNA分子中，(Ａα+ Tα+ Aβ+Tβ）／(Gα+Cα＋Ｇβ+Cβ)= 2（Aα+Tα)/2（Ｇα+Cα）= ０.7１2．什么是DNA变性?ＤNA变性后理化性质有何变化?解答：DNA双链转化成单链的过程称变性。
引起ＤNA变性的因素很多,如高温、超声波、强酸、强碱、有机溶剂和某些化学试剂(如尿素，酰胺)等都能引起变性。
DNA变性后的理化性质变化主要有：①天然ＤNＡ分子的双螺旋结构解链变成单链的无规则线团,生物学活性丧失；②天然的线型DＮA分子直径与长度之比可达1∶１0,其水溶液具有很大的黏度。
变性后,发生了螺旋-线团转变,黏度显著降低;③在氯化铯溶液中进行密度梯度离心，变性后的DNA 浮力密度大大增加，故沉降系数Ｓ增加;④ DNA 变性后,碱基的有序堆积被破坏,碱基被暴露出来,因此，紫外吸收值明显增加,产生所谓增色效应。
⑤ DN Ａ分子具旋光性,旋光方向为右旋。
由于D ＮＡ分子的高度不对称性,因此旋光性很强,其［ａ] ＝ 150。
当ＤN Ａ分子变性时，比旋光值就大大下降。