微生物与转基因技术摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。

通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。

本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。

在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。

此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。

关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体1引言转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。

基因片段[1]的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。

基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。

该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。

1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。

自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。

其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。

2微生物与转基因技术1.微生物与转基因工具酶转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。

DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。

耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。

依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。

核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。

核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。

基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。

2.微生物与转基因载体转基因载体应具有以下基本特性：①必须是一个可独立复制DNA或复制单位；②分子量尽可能小，便于分离纯化和进行离体操作；③分子内具有不影响载体复制、生长的区域，区域中包含多种限制性内切酶的单一切点，确保能在切点内与外源DNA发生重组；④具有区分转化、重组与非重组的多种可供选择的遗传标记（如营养缺陷型、抗药性、噬菌斑形成能力等）。

原核生物的常用克隆载体包括质料载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒载体、原核生物的人工染色体载体等。

酵母菌中的外源基因克隆，可就用载体、电转化和醋酸导入等方法。

依据酵母菌的质料载体构成与复制方式不同，可划分为：整合性载体、附加体载体、复制型载体、着丝粒载体和酵母人工染色体共5类。

3微生物与转基因技术的应用一．转基因微生物在食品生产领域的应用1．转基因微生物生产食品用酶制剂直接用作食品的转基因微生物如发酵食品菌等目前在市场上尚未出现。

在国外，将转101基因细菌和真菌生产的酶用于食品生产和加工已经比较普遍，如奶酪生产中使用的凝乳酶、啤酒和饮料生产中的淀粉酶，以及面包等食品生产中的蛋白酶等。

在食品工业中，微生物可用于生产酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、色素、香料等添加剂。

氨基酸、有机酸、维生素、色素和香料等生产菌种的改良涉及到的基因较多，调控复杂，不易利用基因工程技术进行改良，大多仍处于研究阶段，只有少数氨基酸和维生素以转基因微生物生产。

而酶制剂应用广泛，涉及的基因单一，适合利用基因工程技术进行改良(王家勤1999)。

目前工业上着重于对乳酸菌和酵母菌的基因工程改良。

利用基因工程技术改良菌种生产的第一种食品酶制剂是凝乳酶，始于1998年。

这一技术已得到了广泛的应用，到2001年，已有17个国家使用转基因微生物的凝乳酶生产干酪。

据估计，美国有2，3到3／4的奶酪在生产过程中使用了遗传工程凝乳酶(刘谦等2001)。

目前被批准使用的转基因微生物凝乳酶产品有3种，其基因表现的宿主分别为A．niger，K L-∞fis以及E．coil K12。

(朱文深2001)。

在全球范围内，很多企业已成功地应用转基因微生物生产食品酶制剂，如丹麦的Novo-Nordisk公司和荷兰的Gist．Brocades公司。

生产食品酶制剂的转基因微生物包括浅青紫链霉菌、锈赤链霉菌、枯草芽孢菌、地衣芽孢杆菌、特氏克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等(陈红兵等2001)。

2．转基因酵母在啤酒葡萄酒生产上的应用转基因酵母菌在食品生产上的应用也较为多见，目前已获准商业化使用的转基因酵母菌有面包酵母和啤酒酵母。

利用转基因啤酒酵母所生产的啤酒已被消费者试用，但尚未在市场上得以推广。

转基因方法还用于葡萄酒酵母工程菌的育种，已对苹果酸．乳酸发酵基因及其节基因进行了定位和序列分析，试图把乳酸菌中的苹果酸一乳酸发酵酶基因通过遗传转化导入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精发酵的同时，赋予其苹果酸．乳酸发酵降酸的功能(张春晖等2000)。

二、转基因微生物在农业方面的应用传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素等直接从生物体的组织、细胞或血液中提取，受原料来源限制，价格十分昂贵。

利用基因工程方法制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品，如细胞因子（即淋巴因子如白细胞介素-2、干扰素）、抗体、疫苗、激素等。

转基因产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。

据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，而且还在持续增长。

在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。

2. 人生长激素人生长激素（hGH），又叫做促生长素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病诸如垂体性侏儒症、特纳氏综合症、组织坏死等，都具有良好的治疗效果。

hGH的来源是从死人的脑垂体中提取，这种制备方法不仅材料来源困难，无法大量生产，而且存在安全性问题。

1985年，这种由E.coli 生产的rhGH已成为得到美国政府许可生产和使用的第二种基因工程药物。

3. 基因工程疫苗自从200多年前人们发现，预先接种过牛痘的人能够抵御天花感染的现象，并据此提出免疫的概念后，疫苗就已被广泛地用来预防多种传染病的传播。

基因工程疫苗是使用DNA 重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。

应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。

基因工程疫苗包括基因缺失活疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、蛋白工程疫苗。

三．转基因微生物在农业方面的应用1997--1999年，经农业部农业生物基因工程安全委员会批准的转基因微生物的中间试验有29项，其中22项为植物用转基因微生物，7项为兽用转基因微生物：同期经批准的转基因微生物的环境释放有7项，其中6项为植物用转基因微生物，1项为兽用转基因微生物。

1．转基因微生物农药1980年代中期以来，国内外在防病杀虫转基因微生物的研究方面取得了一系列突破性进展，转基因微生物制品领先于转基因植物进入商业化应用，其中重要的有防治虫害的Bt 高效工程菌剂、转基因病毒制剂、防治植物霜冻的无冰核活性工程菌、防治果树根癌病的放射土壤杆菌工程菌K1026等。

中国的转基因微生物农药主要以苏云金芽孢杆菌(Bt)基因工程制剂和转基因病毒制102剂为主，一批拥有自主知识产权的重组微生物农药产品已初具产业规模，转Bt基因重组杆状病毒、高毒广谱杀虫工程菌、棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂等多种基因工程微生物杀虫剂经农业部安全性审批获准进入田间释放或中间试验。

(1)转基因Bt菌剂。

苏云金杆菌(简称Bt)杀虫剂是公认的一类无公害的生物农药，是目前国内外生产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。

自1981年Schnepf分离了第一个cry基因以来，全世界从Bt中发现并正式命名的ICP基因已有42大类，总数超过250种。

国外已有CoMer、MVP等10余种Bt工程菌制剂投入商业化应用。

美国Ecogen、Novartis、Mycogen和Research Seed等公司生产的转Bt遗传工程菌己通过美国环保局和农业部的批准进入商业化生产。

美国Mycogen公司将苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因导入荧光假单孢菌，并在其发酵生成晶体蛋白后将菌体细胞灭活，用这种“生物微囊”技术加工的菌剂对紫外线的抵抗力可提高36倍，自1991年起已有MVP、M．Trak及M．Peril等多个产品获准登记，用于防治小菜蛾等蔬菜害虫、马铃薯甲虫和玉米螟等。

(2)转基因病毒杀虫剂。

国外近年尝试通过基因工程方法将不同的外源杀虫基因导入野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)，研究取得了良好的进展。

中国科学家将蝎神经毒素基因(AalT)和缺失蜕皮激素UTP葡萄糖苷转移酶(egt-)基因导入棉铃虫核多角体病毒(HasNI Ⅳ)，得到了杀虫速度明显加快的重组HaSNPV(黄大防2003)。

武汉病毒所在国际上首次成功构建了3株缺失egt基因的霞组中国棉铃虫病毒，被农业部“农业微生物遗传工程体安全管理委员会”审批为安全性等级I级，分别于1998年、1031999年、2000年批准进入田间中间试验和环境释放，其中重组棉铃虫病毒1号是中国第一例通过国家安全性评估进入田间中间试验和环境释放的重组病毒杀虫剂，目前正进行中试生产，可望成为中国第二代病毒杀虫剂(中国科学院武汉病毒研究所)。