中性pH条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌氧氧化Arch Microbiol 1998, 169:159-165 IF= 1.975摘要：百分之九十的厌氧富集培养都出自于一些淡水沉积物试样以及一些海洋沉积物，在pH 7.2、30℃条件下下，沉积物中的亚铁离子在硝酸盐和有机辅助物的矿物媒介中被氧化。

厌氧硝化的亚铁氧化是一个生物过程。

从苦咸水沉积物中分离出的一种微生物（HidR2，运动型不产芽孢的革兰氏阴性棒状菌），进一步研究在醋酸盐环境中对亚铁离子的氧化作用。

在微量醋酸盐（0.2~1.1 mM）环境中，pH 7.2、30℃条件下，HidR2菌能厌氧和好氧氧化0.7~4.9 mM的亚铁离子，其用于生长的能量来自于亚铁离子的厌氧硝化氧化，铁氧化比率是一个常数，取决于醋酸盐的量的给予。

中性条件下硝酸盐厌氧氧化亚铁离子的能力似乎是嗜温反硝化细菌的共有特性。

由于依赖硝酸盐的铁离子氧化关闭沉积物缺氧区的铁循环、铁离子的好氧氧化促进含氧区内的二价铁再氧化为三价铁，这两个过程都增加了铁离子在自然沉积物的有机质循环转化中作为过渡电子载体的重要性。

关键词：铁氧化亚铁离子高铁离子硝酸还原作用沉积物1 引言铁元素是地壳中含量最丰富的元素之一，也是含量第二丰富的金属元素。

由于其低水溶性，铁氧化物在水环境中通常以沉淀形式存在，如复杂的非晶形或晶体结构(Cornell and Schwertmann 1996)。

三价铁离子能够被异养菌还原为二价铁离子(Lovley 1991)，在有氧条件下，亚铁离子可以在低pH值中被嗜酸细菌如氧化亚铁硫杆菌再次氧化(Blake et al. 1993)，或者在近中性环境里，被铁锈色披毛菌氧化(Hallbeck et al. 1993)，这两种细菌都是从氧化还原反应中获取能量而生长。

Fe3+/Fe2+的标准氧化还原电位为+770 mV，但是在自然环境中其实际的氧化还原电位很大程度上取决于pH值的变化(Widdelet al. 1993)。

在pH 7的碳酸氢盐环境下，FeOOH/FeCO3的氧化还原过渡电位E值约为+200 mV。

在较低的氧化还原电位下，亚铁离子也能够充当给电子体，从而在厌氧环境中发生还原反应，最近有研究者可以分离和描述能利用亚铁离子作为电子供体的不产氧光合细菌(Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994)。

+200 mV下的释放电子也可以用作微生物的硝酸盐异化作用，最近报道了一种嗜温细菌(Straub et al. 1996)和一种极端嗜热的古细菌(Hafenbradl et al. 1996)都具有这种新陈代谢功能。

这一过程将铁循环和氮循环联系上，因此也显示了微生物厌氧环境中铁离子作为电子受体的重要性。

本文主要研究在兼性厌氧硝酸还原菌辅助作用下亚铁离子的氧化过程。

2 材料和方法2.1 微生物的来源由于采取加富培养，各种沉积物试样被作为接种源，有淡水源（V orsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany）、海水源（Venice, Italy; Ameland and Groningen, Netherlands）、盐水源（Hiddensee,Germany）以及市政污水处理中使用的活性污泥源（Ko nstanz,Germany）。

2.2 培养介质和培养方法对于淡水和海水中细菌的加富培养，使用在缺氧条件下的碳酸氢盐缓冲溶液作矿质媒介，且加入1mM的硫酸盐作为硫源，不需加还原剂，NaCl和MgCl2的浓度则与微生物本身的环境相适应，淡水中NaCl和MgCl2 · 6H2O的量分别为1.0 g和0.4 g，盐水中为7.0 g和1.0 g 海水中则为20.0 g和3.0 g。

经高压灭菌，N2/CO2(80:20, v/v)冷却后，每升溶液中分别加入1 ml微量元素溶液SL9(Tschech and Pfennig 1984)和7-维生素溶液(Widdel and Pfennig 1981)，并将pH调至7.2,。

而对于需氧培养实验，培养基仍和上述方法一样，所不同的是缓冲溶液由羟乙基哌嗪乙硫磺酸所替代。

2.3 富集与分离将50ml 高压灭菌后的培养基装入120ml规格的血清瓶中，用丁基橡皮塞密封好，在缺氧条件下往里加入约5ml的接种体。

并无菌地向基底分别注入浓度为4mM 硫酸亚铁和5mM 硝酸盐。

每个接种体均在pH为6.5、7.0、8.0，温度为16和30℃下富集培养。

培养周期为2~4周，以棕色锈状沉淀形成为一个周期。

苦咸水培养的细菌的纯化是用的琼脂稀释法(Pfennig and Trüper 1981)：60℃下向25ml 的试管中加入3ml 3%（w/v）的琼脂溶液，再加入8 mM 硫酸亚铁溶液，小心混匀，然后，加入7ml 42℃预热的含5 mM硝酸盐培养基，得到的亚铁离子最终浓度为4 mM。

每根稀释后的试管都经过密封、接种、水域冷凝以及N2/CO2 (80:20, v/v)气体吹扫，最后置于避光的30℃恒温箱中培养。

在进入液体培养基前，微生物都是在琼脂上生长繁殖的。

淡水和海水微生物的纯培养在平板基上分离。

平板基的基质也是上述培养基加入0.01M 丙磺酸作为缓冲溶液、1.5%（w/v）的琼脂、5mM 硝酸盐和3 mM 醋酸盐。

在30℃，N2/CO2(80:20, v/v)气氛下进行避光平板接种。

培养好的菌种转移到呈有淡水培养基的血清瓶（60ml）中。

只有在瓶子中进行亚铁离子氧化的微生物才在琼脂板上显示多于两条条纹从而得以纯化，并且将其转移到液体培养基中培养。

在含有矿物质元素和0.2%的酵母膏的培养基中培养后的微生物在显微镜下进行纯化检查。

培养期间需定期用显微镜检查微生物是否被污染。

检测鞭毛是否形成，使用的方法是布雷登-戈登堡银侵染法。

2.4 增长实验细菌在装有300ml培养基的瓶（500ml）中培养，未接种的空白试验瓶在相同条件下培养至少两个月，但是始终未见到有能氧化二价铁离子的微生物产生。

经过震荡后的样品放入具塞瓶中，用N2/CO2 (80:20, v/v)气预吹，然后转移到盐酸或者磷酸缓冲溶液中准备下一步分析。

为保证在氧气梯度管中的生长实验，将4ml 缺氧培养基装入22ml试管中，培养基中含有1.5% (w/v)琼脂糖、15 mM 亚铁离子、1 mM醋酸盐。

在氮气保护下，等第一层凝结后，再加入第二层培养基（0.5% (w/v)琼脂糖），将微生物接种在这一层上。

等到第二层氮气保护下凝固好以后再往上面加入1ml原培养基不含琼脂糖，为的是防止第二层琼脂糖的干结。

试管用铝盖轻轻盖上，垂直放入暗箱中在30℃下，振荡培养（80rpm）。

以上所有试验重复一遍2.5 分析方法亚铁离子的量用亚铁嗪分光光度法来测定(Stookey 1970)。

总铁离子的浓度测定也是用同样的方法即加入盐酸羟胺将所有的铁离子都还原成亚铁离子态(Stookey 1970)。

三价铁离子则有上述二者差值得到。

为得到亚硝酸盐的含量，样品与一体积500mM的磷酸缓冲溶液在厌氧环境下混合，并在室温下反应15分钟，然后在离心机上用最大转速离心5分钟。

用1ml 1M的盐酸将其又恢复粒子态。

这样处理可以避免亚硝酸盐在分析前和分析过程中被亚铁离子所氧化。

如果试样中含有超过1mM的亚硝酸盐，则这个过程必须重复至少两次。

由于铁离子分析是在梯度管中进行的，所以琼脂糖要用刀片切成2mm后的薄片并加入1ml 5M的盐酸。

在40℃水浴中静置15分钟后，薄片已被酸化成液体，铁离子在上述过程中被测量完毕。

硝酸盐和亚硝酸盐用带有格鲁姆阴离子交换柱(Grom, Herrenberg, Germany)的高效液相色谱来进行定量分析，在220nm下进行吸收检测。

为了抑制铁离子和亚硝酸盐的相互反应，并且为保护色谱柱，含铁样品中得加入磷酸缓冲溶液，上清液用于硝酸盐亚硝酸盐的检测。

这种方法的对亚硝酸盐的检出限大约是30 μM。

醋酸盐用气相色谱（GC6000 Vega Series 2; Carlo Erba, Milan, Italy）分析，使用填充柱（2 m×2mm; 60/80 Carbopack C/0.3% carbowax 20 M/0.1% H3PO4），火焰离子检测器。

为了保护柱子，醋酸盐试样也按上述方法准备。

氧化二氮也用上述气相色谱分析，使用的填充柱[2 m×2 mm; 60/80 Carbosieve SII (Supelco, Bellefonte, Pa., USA)]和检测器（热导池检测器）不一样。

根据Hall 和Aller (1992)，铵盐用流动注射分析。

蛋白质由以下分析：测定含铁样品中蛋白质的含量，需要准备含有试样中相同铁量的蛋白质标样，为的是测定蛋白质化学分析中与铁离子的可能反应。

由于几种HidR2菌所对应的不同的光密度的蛋白质含量与干重呈一种相关关系，根据这种关系，可以来计算蛋白质的干重。

梯度管中的氧含量用三维显微操作器驱动氧微电极而测定。

3 结果3.1 富集培养在7~10天的培养下，除了威尼斯海峡采集的沉积物以外，所有的富集培养都形成了棕色锈状沉淀。

通过化学分析，这些沉淀都被确定为铁的氢氧化物，而在未富集培养的培养基里都未发现亚铁的氧化作用。

经过三到四次转移培养，需加入醋酸盐或者琥珀酸盐作为有机补给物以维持亚铁离子的氧化作用环境。

只有从格罗宁根市海洋沉淀物中富集培养的培养基不用加入补给物而能不断氧化亚铁离子，即使重复转移一年以上也能进行反应。

在比较所有富集培养后发现，无论是在16℃或30℃还是pH为6.5或8，亚铁离子的转化率和潜伏程度都没有明显的改变。

3.2 纯培养的特征从所有能发生亚铁离子氧化反应的富集培养中来看，纯培养独立的显示了亚铁离子厌氧氧化过程中醋酸盐是作为有机补给物而硝酸盐则是作为电子受体。

从波罗的海沉积物中分离出来的HidR2菌种将被作为进一步研究的对象。

图1HidR2菌在醋酸盐和硝酸盐厌氧生长中的相差显微镜照片（图中横杠表示10微米）HidR2菌属于革兰氏阴性，不产孢子的杆菌，大小为3~6×1μm（图1），单极鞭毛运动型，对氧化酶和过氧化氢酶产生极性。

通过相差显微镜观察到细胞两端有微小深色包涵体，用三氯甲烷处理后，这些包涵体消失，可能是由于聚羟基脂肪酸的富集产生。

在过量醋酸盐（＞3 mM）中培养后，HidR2菌每一批能产生约10~50个细胞。

在含有亚铁离子、醋酸盐和硝酸盐的液体培养基中，通过4,6-二脒基-2-苯吲哚盐酸染色法，可以发现绝大多数细胞都含有絮状的三氧化铁或者肉眼可见的姜铁矿，但氢氧化铁并非包裹在细胞外部。