电泳技术基本原理和步骤
目录
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节 • 第五节 • 第六节 • 第七节 • 第八节
区带电泳 等电聚焦电泳 SDS-PAGE电泳 二维电泳 印迹技术 免疫电泳 高效毛细管电泳技术 电泳分析仪
基本原理
不同性质的质点，由于带电性质及电量不同，在 一定电场强度下移动的方向和速度亦不同。
第二节 等电聚焦电泳
• 区带电泳的原理是不同的蛋白质有不同的电泳速度
• 那么可不可以有另外一种方法：使得不同蛋白质在 泳道中本来就有“固定”位置，蛋白质在相应的位 置上停留？
• 蛋白质如何能够停止电泳？
• 除了切断电源之外？
• 蛋白质不带电了——蛋白质处于等电点溶液中
第二节 等电聚焦电泳
• 基本原理 在等电聚焦电泳时必须有一个稳定的pH梯度介
第四节 二维电泳
• 检验医学中的应用
一个问题：如何确定某个条带 是什么蛋白质？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法－－基本原理
图 6-13 免疫印迹法的原理
第五节 印迹技术
区带电泳
• 检验医学中的应用－－ 同工酶电泳
图6-3 LDH同工酶区带电泳图谱 左：5份血清iso-LDH电泳图；右：iso-LDH电泳示意图
第一节 区带电泳
• 检验医学中的应用－－ 同工酶电泳
图6-4 CK同工酶示意图 左：血清iso-CK电泳图，3示正 常血清（CK MB<5%），1、2、 4示急性心梗（CK MB>5%）；4 示CK BB阳性； 右：iso-CK电泳图谱示意图
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第二节 等电聚焦电泳
• 检验医学中的应用－－次级同工酶的分离
图 6-5 碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱 左：iso-ALP等电聚焦示意图；右：胆道梗阻性疾病iso-ALP电泳图谱
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白 质负载了大量负电荷，大大超过了天然 蛋白质的原有电荷，因此蛋白质之间原 有电荷的差异就无显著效应，蛋白质带 电量的多少，只与蛋白质大小即分子量 有关，此时，不同泳动速率仅反映了各 蛋白质亚基的分子量的差别。
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-7 非浓缩尿蛋白电泳 示意图
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱 左：肾小球性蛋白尿； 中：肾小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型； 右：混合型蛋白尿
一个条带中仍是混合着多种蛋 白质，如何再把它们分开呢？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
区带电泳
A
B
C
D
图6-2 几种常见异常血清蛋白图谱 A：双清蛋白血清电泳图；B：慢性肝病或肝硬变常见的-融 合的桥连现象；C：免疫球蛋白寡克隆增生型；D：M蛋白血 清型（IgA型）；N：正常对照血清；P：患者血清
蛋白质分子为两性电解质 等电点 pH>等电点 带负电 pH<等电点 带正电
基本原理
质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远） 质点的直径越小 越接近球形 则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。
区带电泳
• 检验医学中的应用－－血清蛋白电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
第四节 二维电泳
图 6-9 二维电泳原理及流程图
第四节 二维电泳
• 基本原理
第一维电泳，即等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)其基本原理是利用蛋白质分子 等电点的不同对其进行分离；
第二维电泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，使电泳迁移率主要取决于蛋白 质或亚基分子量的大小。
区带电泳
• 实验原理 让pH>pI（max） 所有蛋白质带负电 各种蛋白质带电量不同 电泳速度不同 经过一段时间电泳后，各种蛋白质被区分开
区带电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶 α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
• 免疫印迹法（Immunoblotting） 又称蛋白质印迹(Western blot) ，因与早先
建立的检测核酸的Southern blot 相类似，亦被 称为Western blot，是一种借助特异性抗体鉴定 抗原的有效方法。被检测物是蛋白质，“探针” 是抗体，“显色”用标记二抗。
第五节 印迹技术
质，使pH值从正极向负极渐次增加，形成一线性 pH梯度。
蛋白质混合物加入有pH梯度的电泳管中，在电 场中经一定时间后，混合物中各组分将分别聚焦在 与各等电点相应的pH介质区域，形成分离的各种蛋 白质区带。这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基本 原理。
第三节 SDS-PAGE电泳
• 等电聚焦根据等电点将蛋白质分离
共分三个阶段进行
– SDS-PAGE – 电转移 – 酶免疫定位
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法在检验医学中的应用
– 自身抗体检测中的应用
第五节 印迹技术
图 6-14 免疫印迹法在自身抗体ENA检测中的应用
第六节 免疫电泳
电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了 其临床应用的范围，于1953年Grabar和Williams 首次将凝胶扩散置于直流电场中进行，让电流 来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向， 并与免疫沉淀反应相结合,该技术有两大优点， 一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白 组分利用其带电荷的不同而将其分离开，再分 别与其对应抗体反应，以此作更细微的分析。
• 那还能不能根据其他性质将蛋白质分离?
• 区带电泳的电泳速度的影响条件较多 （大小、电荷、形状），不是根据单一 性质分离
• 有一种方法能根据蛋白质的分子量使之 带上相应的电荷，远远大于蛋白质本身 电荷的大小，并使电荷成为电泳速度的 主要决定因素，那么电泳速度只和分子 量相关
第三节 SDS-PAGE电泳