2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液 中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时 使各管溶液混杂。
7. 思考题
1）何谓酶的最适pH和最适温度？ 2）酶有哪些催化特性？ 3）影响酶促反应速度的因素有哪些？
2.实验原理
过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的 有 剂害铁的粉高H21O02分个解数成量H级2。O和O2，其催化效率比无机催化
酶的另一特点是具有高度的特异（专一）性，淀粉酶 和蔗糖酶虽然都催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对 淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。
通过比较淀粉酶在不同pH，不同温度以及有无抑制 剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与 酶活性的关系。
6
淀粉酶活力测定
6
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳
6
质粒的提取、电泳
6
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 (综合性实验)
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实验时间：双周，第二周开始！
要求： 勤于动脑、善于动手！
参考书目
生物化学实验技术 郭蔼光 郭泽坤 主编 高等教育出版社
生物化学实验方法与技术 科学出版社
陈毓荃 主编
具体参见实验指导书
5. 结果处理
用－、+、++、+++等符号表示各管的混 浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最 混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
6. 注意事项
缓冲液的pH值必须准确。
7. 思考题
1）解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的 原因。
2）该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法）
3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤
具体参见实验指导书
5. 结果处理
根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得 相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白质含量(g/g鲜重)
查得的蛋白质含量(g) 提取液总体积(ml) 样品鲜重(g) 测定时取用提取液体积(ml)
6. 注意事项
比色应在出现蓝色后2min~1h内完成。
7. 思考题
1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的 原理是什么？
2）如何正确使用分光光度计？
3）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理 有哪些不同？
酶的基本性质
1.目的 酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，
生物体内的化学反应基本上都是在酶催化下 进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、 特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对 酶力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其 调控机理具有十分重要的意义。
许多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯 基、酚基等，因此与AA一样，能象酸一样 解离，也能象碱一样解离，也是两性电解质。
2.2.2 蛋白质的等电点
当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等， 即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电 点(isoelectric point)。
3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤
2.1 pH对酶促反应速度的影响
2.2 温度对酶促反应速度的影响
3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤
具体参见实验指导书.
5. 结果处理
具体参见实验指导书.
6. 注意事项
1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验3、4、5 应随时检查反应进行情况。如反应进行太快，应适当 稀释唾液；反之，则应增大唾液淀粉酶浓度。
2.1氨基酸的两性解离和等电点
2.1.1 氨基酸的两性解离
R H3N+ CH
COOH
K'1
R H3N+ CH
-
COO
K'2
H2N
R CH
-
COO
酸性溶液中的AA 水溶液中的AA 碱性溶液中有AA （阳离子） （兼性离子） （阴离子）
2.1.2 氨基酸等电点（isoelectric point)
在一定pH值时，氨基酸以兼性离子存在，在电场中
生物化学实验课件
概述
通过实验课，掌握比色、层析、电泳等基本 实验方法的原理和操作技能，学会选择正确 的方法进行生物材料中多种物质的分离、提 纯及鉴定。
通过实验加深对生物化学基本原理的理解。
实验内容
蛋白质的两性性质和等电点测定
3
蛋白质含量测定（考马斯亮兰）
4
酶的基本性质
5
转氨酶活性鉴定（纸层析法）
蛋白质的两性性质和等电点测定
1.实验目的
1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点 与蛋白质分子聚沉的关系。
2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
2.实验原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的 羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和 Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。
1.实验目的
1）通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法 测定蛋白质含量的原理。
2）了解分光光度计的结构、原理和在比 色法中的应用。
2.实验原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它 与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在 0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用 比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法 （Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合 方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种 较好的蛋白质常用分析方法。
不会向正、负酸极移动，此时的pH值称氨基酸的 等电点（pI）。
酸性氨基酸 碱性氨基酸
pI= 1/2 (pK1’ +pK2’) pI= 1/2(pK1’ +pKR’) pI= 1/2(pK2’ +pKR’)
2.2 蛋白质的两性电离及等电点
2.2.1蛋白质的两性电离 蛋白质是由AA组成的高分子化合物，具有
在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
= pI
电场中： 移向阳极
不移动
阳离子 pH＜pI
移向阴极
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等， 净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的缓冲液， 观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。在pH 梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电 点不同的蛋白质。