微生物检验操作规程
1. 目的
建立微生物检验标准操作规程, 保证检验操作规范化。

2. 范围
适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。

3. 职责
3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程;
3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。

4. 操作规程
4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤
4.1.1 一般的玻璃器皿( 例如培养皿、试管、三角瓶等) , 可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢, 然后用自来水、蒸馏水充分冲洗, 直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜, 即器壁既不挂水珠也无条纹, 即洗涤达到标准。

4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时, 可浸泡于洗液中, 待器皿中有机物氧化分解后, 取出用自来水、蒸馏水冲洗干净, 备用。

4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡, 再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。

4.2 器皿的包扎
4.2.1 试管: 塞上胶塞, 然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。

做发酵试验时, 将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。

4.2.2 三角瓶、抽滤瓶: 将三角瓶( 抽滤瓶) 口塞上胶塞, 然后用牛皮纸把塞头部包起来。

4.2.3 吸管: 将耐高温的移液枪头装盒, 用用牛皮纸或报纸包裹。

4.2.4 平皿: 10个为一组, 用牛皮纸包裹。

4.3消毒和灭菌:
4.3.1 化学灭菌: 此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。

如人手等。

( 1) 用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。

( 2) 一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。

( 3) 一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。

使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内, ( 对金属有腐蚀作用) 放置10～15min后冲洗即可。

( 4) 氯灭菌剂的能力以有效氯表示, 将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液, 可用于浸泡, 冲洗和表面杀菌。

但氯对金属有腐蚀作用。

4.3.2 物理灭菌:
4.3.2.1 干热灭菌: 适用于干燥的玻璃器皿( 吸管、平皿等) 、金属器具( 镊子等) 、固体试液、液状石蜡等。

灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。

( 1) 器具用牛皮纸或灭菌袋包( 装) 扎, 放入金属容器内。

( 2) 器具在干燥箱加热前放入, 每个器具之间留有足够的空隙, 使热
空气能畅通。

( 3) 关闭箱门接通电源, 打开通气孔, 使箱内湿空气能逸出, 至箱内温度达到100℃时关闭。

( 4) 加热至160℃, 保持2小时。

( 5) 切断电源, 冷却至60℃时, 打开箱门, 取出灭菌器具, 并打开箱顶通气口。

注: 灭菌时必须注意温度不能超过180℃, 以免使棉花、报纸烘焦; 灭菌时不得打开箱门; 干燥箱未冷却时, 不要取出里面器具, 防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸
璃器具爆炸。

4.3.2.2 湿热灭菌: 适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其它遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。

详见《压力蒸汽灭菌器操作规程》。

( 1) 装入培养基的瓶用胶塞盖上, 再用牛皮纸包扎。

( 2) 瓶中的培养液不要超过1L, 否则灭菌不彻底。

( 3) 容器的上部应留有足够的空间( 一般不超过装量的2/3) , 以便产生气泡。

( 4) 器具用牛皮纸包裹。

( 5) 器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。

( 6) 各类器具装入灭菌器时, 相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。

4.4 无菌操作的准备工作及注意事项
4.4.1 微生物室应定期按《微生物实验室管理规程》清洁。

4.4.2 微生物室使用前, 应先打开紫外灯灭菌20～30min。

4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针, 每次使用前后应灭菌消毒。

4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球; 新洁尔灭消毒液内浸纱布数块, 备用。

4.4.5 进入微生物, 换专用鞋, 穿好洁净服, 离室时脱去洁净服和专用鞋, 洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用, 不准穿到其它地方去, 并定期洗换和消毒灭菌。

4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容, 并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。

4.4.7 无菌操作前, 用75%的酒精棉球擦手。

4.4.8 操作要正确迅速, 所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。

4.4.9 检验完毕, 立即清理工作台, 弃去不需要物品, 打开紫外灯灭菌20～30min。

4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存
配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。

4.5.1 水: 电导率在25℃时不超过25μs/cm, 除非另有规定要求。

4.5.2 称重和溶解:
保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定, 已制备好的培养基要保存于冰箱中。

在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min, 使其与室温一致再使用, 因为气体的溶解度可因温度上升而降低, 特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡, 这一点必须注意。

4.5.3 pH 的测定和调整:
用pH计测pH, 必要时在灭菌前进行调整, 除特殊说明外, 培养基灭菌后冷却至25℃时, pH应在标准pH±0.2范围内。

一般使用浓度约为40g/L( 约1mol/L) 的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L( 约1mol/L) 的
盐酸溶液调整培养基的pH。

4.5.4 分装: 将配好的培养基分装到适当的容器中, 容器的体积应比培养基体积最少大20%。

4.5.6 培养基的使用:
经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间, 融化后避免过度加热。

融化后应短暂置于室温中( 如2 min) 以避免玻璃瓶破碎。

融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温, 且应尽快使用, 放置时间一般不应超过4 h。

未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。

敏感的培养基尤应注意, 融化后保温时间应尽量缩短, 如有特定要求可参考指定的标准。

4.5.7平板的制备和储存
倾注融化的培养基到平皿中, 使之在平皿中形成厚度至少为 3 mm( 直径90 mm的平皿, 一般要加入18 mL～20 mL琼脂培养基) 。

将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。

如果平板需储存, 或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃, 则需要倾注更多的培养基。

凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和( 或) 5℃±3℃冰箱的密封袋中, 以防止培养基成分的改变。

在平板底部或侧边做好标记, 标记的内容包括名称、制备日期和( 或) 有效期。

也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。

为了避免冷凝水的产生, 平板应冷却后再装入袋中。

储存前不要对培养基表面进行干燥处理。

对于采用表面接种形式培养的固体培养基, 应先对琼脂表面进行干燥: 揭开平皿盖, 将平板倒扣于烘箱或培养箱中( 温度设为25℃～50℃) ; 或放在有对流的无菌净化台中, 直到培养基表面的水滴消失为止。

注意不要过度干燥。

商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

4.6 检验方法
做样前, 将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上, 操作台、微生物室紫外线灭菌30min, 然后关紫外线灭菌灯, 开启净风循环30min后开始做样。

详见附录各检测方法
附录1 菌落总数测定
附录2 霉菌和酵母计数
附录3 大肠菌群计数
附录4 大肠埃希氏菌计数
附录5 沙门氏菌检验
附录6 金黄色葡萄球菌检验
附录1
菌落总数的测定方法
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品: 称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min～2 min制成1:10 的样品匀液。