药典分析方法验证和确认usp37 1225 1226 <1225>药典分析方法验证用于评价药物质量的检验方法应符合一定要求。

根据联邦食品、药品、化妆品第501条的规定，在美国药典(USP)和国家处方集(NF)的正文检验方法和规定为法定标准。

按照现行药品生产管理规范有关条文[21 CFR 211.194(a)]要求，用于评价药品是否符合既定标准规定的分析方法应具有一定准确性和可靠性。

按照该要求[21 CFR 211.194(a)(2)]，USP和NF分析方法使用者不必验证方法的准确性和可靠性，但要确认在实际使用条件下的适用性。

考虑到USP和NF标准法定地位这一基本情况，所以，药典品种新方法或修订方法得建议，应由充分实验室数据支持，以说明方法有效。

本指导通则内容尽可能与三方国际协调会(ICH)关于在欧盟、日本和美国注册申报资料要求中与分析方法部分有关的分析方法验证和方法学文本一致。

药典申报新的或修订的分析方法得药典申报，应报送充分的资料，以便美国药典委员会专家理事会及其专家委员会建议的方法是否清晰完整，需要建立该方法的结论，以及方法验证文本。

方法类型不同，申报要求可能不同，一般包括下列内容: 理由写明需要本方法的理由、用途以及与其他方法比较的优点。

修订的方法应写明现行药典方法的局限性以及建议方法得优点。

建议的分析方法应完整详细地写明建议的分析方法，以便他人依法操作。

文字应包括全部重要的操作参数和有关事项以及明确的试验结果计算公式。

数据元素本部分要求提供详细、完整的分析方法验证文件，文件应包括实验数据及各适用的分析方法运行特性计算结果。

运行特性在下文中叙述。

验证分析方法验证是通过实验室研究证明该分析方法的运行特性符合其分析应用要求的过程。

表1中列出了本文分析方法验证需考虑的典型分析运行特性。

由于对术语有不同的理解和用法，本通则以下部分包括各运行特性的定义以及衡量特性的方法描述。

定义与“测定结果”有关。

分析方法的叙述应写清该方法得测定结果是什么。

ISO5725-1和3534-1指出，“测定结果是用特定测定方法得到的特性值。

分析方法应规定进行一次还是数次单独测定，作为测定结果报告的平均值，或其他适宜函数(如，中位数或标准偏差)。

可能要求做标准校正，如气体体积校正到标准温度和压力时的体积。

所以测定结果可以是数个观察值的计算结果。

简单试验时，测定结果就是观察值本身”。

测定结果是用于与标准规定限度比较的最终报告值，但偶有例外。

物理性质测定方法验证可能包括化学计量模型。

方法验证中用到的典型分析特性可用于基于化学计量模型的方法。

表1 分析方法验证用典型分析特性准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性用代表性样品进行分析方法验证时，应考虑工艺条件和物料差异的影响。

下列情况下，药典分析方法应进行再验证:报送USP的修订分析方法;或将已有通用方法用于新产品或新物料制成的产品(见下文方法所需数据元素部分)。

国际协调会(ICH)有关文本建议下列情况下需在验证:原料药合成工艺改变;药物制剂组方改变;分析方法改变。

通则<1225>提供适于大多数药典分析方法得验证要求信息。

药典分析方法验证可按照表1中列出的部分或全部分析特性，以及表2中分析方法分类进行。

有的药典分析方法验证要求超出通则<1225>的特性。

则可按各有关方法通则规定的分析验证特性或特殊验证要求进行。

分析运行特性准确度定义分析方法得准确度系指该方法所得测试结果与真值的接近程度。

分析方法的准确度应在一定范围内测定。

[关于术语:通则<1225>和ICH Q2中准确度定义为不偏离程度(真实度)。

但在国际计量学词汇[International Vocabulary of Metrology(VIM)]和国际标准组织[the International Organization for Standardization(ISO)]的文件中，“准确度”有不同的意思。

ISO准确度的定义把不偏离程度(真实度)与精密度的概念合在一起]。

测定对于原料药含量测定，用分析方法测定已知纯度的供试品(如对照品)，或用被验证方法测定结果与其他已知准确度的方法测定结果进行比较，测得准确度。

对于制剂中药物的含量测定，用分析方法测定制剂成分混合物中按照方法范围加入的已知量被测物，测得准确度。

如不能获得全部制剂成分，可向制剂中加入已知量被测物(加样法)进行测定，或用被验证方法测定结果与其他已知准确度的方法测定结果进行比较。

对于杂质定量分析，原料药或制剂中加入已知量杂质，测得准确度。

如不可能得到某些杂质或降解产物，可以将测定结果与另一方法测得结果进行比对。

如没有其他方法，可比较杂质和被测物质的响应值，即等量杂质和被测物响应值比值(相对响应因子)，如果已知该比值，可用于计算杂质含量。

准确度为样品中被测物已知加入量含量测定的百分回收率，或平均值与可接受真值的偏差，同时报告置信区间。

ICH有关文件建议在规定范围至少3个浓度至少测定9次的结果确定准确度(即3个浓度，每个浓度重复测定3次)。

准确度的确定可以用不同方法，包括在含量测定范围内测定被测物回收率(百分回收率)，或测定估计浓度与真实浓度的线性关系。

建议统计判断标准为斜率的置信区间应在约1.0区间内，或斜率应接近1.0。

在验证文件中均应规定区间或接近程度的定义。

判断标准取决于含量测定方法和变异以及结果。

不建议在斜率为1.0时用零假设检验没有统计意义地确定判断标准。

物理性质测定方法的准确度可通过标准物质分析确定，或根据具体情况对上述方法得适用性进行具体分析来确定。

精密度定义分析方法的精密度系指均匀样品多次取样用该分析方法测定各结果的一致程度。

分析方法的精密度常用一系列测定结果的标准偏差或相对标准偏差(变异系数)表示。

精密度衡量在正常操作条件下分析方法的重现性和重复性。

重复性系指不同实验室用该分析方法测定，如协同研究。

中间精密度(也称耐用性)为实验室内差异，即在同一实验室在不同日期，或用不同分析人员，或用不同设备用该分析方法进行测定。

重复性系指在一个实验室由一个分析人员用相同设备在短时间内用该分析方法进行测定。

测定分析方法的精密度是对足够份数的一个均匀样品进行测定，以便计算标准偏差或相对标准偏差(变异系数)统计有效的估计数。

本测定为各份样品从样品制备得到最终结果进行的全部分析过程。

ICH有关文件建议在规定范围至少3个浓度至少测定9次的结果确定准确度(即3个浓度，每个浓度重复测定3次)，或用100%测试浓度至少6次测定结果。

专属性定义 ICH定义专属性在杂质、降解产物以及辅料存在下分析方法能准确确定被测物质存在的能力。

如果缺乏专属性，可用其他分析方法弥补。

[注:国际专业权威机构(IUPSC,AOAC-I)采用“选择性”这个术语，对选择性极高的分析方法保留“专属性”这个术语]。

对于下面讨论的分析方法，以上定义具有以下含义: 鉴别试验:鉴定被分析物特性纯度检查:采用的所有分析方法能给出被测物质中杂质的准确含量(如有关物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查)。

含量测定:给出正确结果，样品中被分析物含量或效价的准确结果。

测定定性分析(鉴别试验)方法。

应能显示区分可能存在的结构十分相关的化合物的能力。

用含有被分析物质的阳性反应(与已知对照品对照)加上不含被测物质样品的阴性反应进行确证，并确证阳性反应不是与被分析物结构相似或十分相关的物质产生的。

杂质分析方法，向原料药或制剂中加入适量杂质，应能显示这些杂质的测定结果具有一定准确度和精密度。

含量测定分析方法，其专属性应能显示该分析方法不受杂质或辅料存在的影响。

实际做法可向原料药或制剂中加入适量杂质或辅料，确定测定结果不受这些外来物质的影响。

如果杂质或降解产物得不到，可将含有杂质或降解产物的样品测定结果与用另一确证了的方法测定结果比较(如药典方法，或其他经验证了的方法)，以说明其专属性。

应包括对贮存在相应苛刻条件下的样品测定比较(如:光、热、湿度、酸或碱水解、以及氧化)。

含量测定分析方法，应比较这些结果;色潜纯度检査应比较杂质的检出情况.ICH有关文件说明，当使用色谱分析方法时，验证资料中应附代表性色谱图，以显示其选择性好坏，应标明每个色谱个峰。

峰纯度检査(如用二极管阵列或质谱法检测)可用于显示被测定物色谱峰仅为一个成分。

用波谱法的定性定量测定方法验证，应参考有关通法，如近红外光谱法、拉曼光谱法、X射线粉末衍射法等。

检测限定义检测限是限度检查的特性。

检测限系指在规定试验条件下样品中被分析物能被检出的最低量，不一定要求定量。

因此，限度检查只要说明被分析物的量髙于或低于一定限度。

检测限通常以样品中被分析物的浓度表示(如百分浓度，十亿分之几)。

测定非仪器分析方法，一般用已知浓度被分析物的样品进行分析，求得该被分析物能被可靠检出的最低浓度。

仪器分析方法，可用与非仪器分析方法相同方法求得检测限。

分析方法推荐作为药典方法时，不必要测定实际的检测限。

实际上，用含高于和低于规定检测浓度的已知浓度被分析物样品求得的检测限是非常低的。

例如，要求检査浓度为0.1%的杂质，应表明，用本法能可靠地检出该浓度的杂质。

具有基线噪音的仪器分析方法，ICH有关文件叙述了一个常用方法，即将含已知低浓度被分析物样品测得的信号与空白样品信号比较。

可以确定可靠检出被分析物的最低浓度。

一般可接受的信噪比为2:1或3:1。

其他方法如按照标准曲线的斜率和响应值的标准偏差计算检测限的。

无论用那种方法，必须用接近检测限或制备成检测限浓度的数个样品，对检测限进行最后验证。

定量限定义定量限是样品基质中低浓度化合物定量测定的特性，如原料药中的杂质和最终药物制剂中的降解产物。

定量限系指在规定试验条件下样品中被分析物能被测定的最低量，且具有可接受的精密度和准确度。

定量限通常以样品中被分析物的浓度表示(如百分浓度，十亿分之几)。

测定非仪器分析方法，一般用已知浓度被分析物的样品进行分析，求得该被分析物能被测定且具有可接受准确度和精密度的最低浓度。

仪器分析方法，可用与非仪器分析方法相同方法求得定量限。

分析方法推荐作为药典方法时，不必要测定实际的定量限。

实际上，用含高于和低于规定定量浓度的已知浓度被分析物样品求得的定量限是非常低的。

例如，要求测定被分析物的浓度为每片0.lmg,应表明，用本法能可靠地定量测定该浓度的被分析物。

具有基线噪音的仪器分析方法，ICH有关文件叙述了一个常用方法，即将含已知低浓度被分析物样品测得的信号与空白样品信号比较。

可以确定可靠测定被分析物的最低浓度。

一般可接受的信噪比为10:1。

其他方法如按照标准曲线的斜率和响应值的标准偏差计算定量限的。

无论用那种方法，必须用接近定量限或制备成定量限浓度的数个样品，对定量限进行最后验证。