ＣＢＳ
ＳＤＡ平板，以直径３ ｌｎｍ的
无菌钻孔器在平板四周打４个孑Ｌ，分别加入１００％ 吐温４０、吐温６０、吐温８０，３５℃培养３ ｄ后观察生 长情况。（２）点种法［Ｉ训：配制０．５麦氏浓度待检菌 液，吸取菌悬液５出分别滴加于含２％吐温２０的 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养５ ｄ，记录结果，明显生长 为阳性，不生长为阴性。 ７．七叶苷分解试验：将待检菌接种于七叶苷琼 脂斜面培养基上，并在斜面上滴ｌ滴橄榄油，３５℃ 培养３ ｄ，观察培养基的颜色变化。培养基斜面变黑 者为阳性，不变色为阴性。 ８．过氧化氢试验：滴加ＩＤ－ＡＳＥ触酶试剂ｌ滴 于吐温一科玛嘉平板上的待检菌菌落上，立即观察，
９７９５由上海华山医院抗生素研究所胡付品博
士馈赠。
２．试剂与仪器：科玛嘉念珠菌显色培养基
（ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｃａｎｄｉｄａ）为法国柯玛嘉产品，沙保弱
琼脂（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＳＤＡ）购自北京陆桥
技术有限责任公司。糠秕马拉色菌分离培养基（筛 选平板）为加１％吐温６０的科玛嘉念珠菌显色培养 基（吐温．科玛嘉平板）。４％蓖麻油的ＳＤＡ平板，加
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ知咖ｒ ｂｙ
Ｐａｒｋｅｒ ｉｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｎＩｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｃｕｌｔｍ刮ｏｎ
ＣＨＲＯＭａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌ％Ｔｗｅｅｎ ６０（ｗｈｉｃｈ ｗａＥ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｕｒｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ，Ｔｗｅｅｎ ｔｅｓｔ，ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ Ｅｓｃａｌｉｎ，Ｃ８ｔａｌ鹤ｅ ｔｅｓｔ，Ｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃａｓｔｏｒ Ｔｈｅ ｏｉｌ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｌ ８ｓ ｒＲＮＡｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ ｆｒｏｍ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗａｓ ４７．４％（６３／１３３）ａｎｄ ６３ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｔｈｏｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １８ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｃａｎ ｂｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｍｅｓＡ＂
马拉色菌为一种嗜脂性酵母，属人体皮肤正常 的菌群，也是一种条件致病真菌。到２０世纪９０年 代中期，有学者基于形态学、超微结构、生理生化特
万方数据
史堡焦熊医堂盘查垫１２生！旦箜翌鲞箜！翅垦竖璺』！些堕鲤，叁坚塾垫！兰：！丛篁：墨垒墨 征以及分子生物学的研究，将马抟色菌分为厚皮马
拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）、合轴马拉色菌
Ｈｏ鸭－ｔＯＯ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅ日堍Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
ｉ００７３０．Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ｃＨＥＮ Ｄｏｎｇ－ｋｅ．Ｅｍａｉｌ Ｉｖ—ｄ－ｋ＠２６３．ｎｅｔ
Ｆｒｏｍ Ｍａｒｃｈ ２０１０
１３３ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅ托ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１ １， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
・７ｌｌ・
．论著．
下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的
分离与鉴定
陈东科许宏涛
【摘要】 目的对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养，并对分离菌株
进行系统鉴定。方法收集２０１０年３月至２０１ １年９月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为 马拉色菌的下呼吸道分泌物标本１３３份，接种于含ｌ％吐温６０的科玛嘉琼脂培养基（即改良念珠菌 显色培养基），于３５℃大气环境中培养。挑取疑似菌落在含０．５％吐温４０和０．５％吐温印的沙保弱 平板上进行纯培养。采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定，包括染色镜检观察菌体形态及 染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油 试验，可疑菌株采用１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定。结果镜检可疑的下呼 吸道分泌物中马拉色菌分离率为４７．４％（６３／１３３），６３株分离菌经传统的表型鉴定方法结合１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌。标本直接涂片，用派克墨水染色镜下可明显区分 马拉色菌和念珠菌。结论糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色，可明显区别 于其他念珠菌菌落，用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率。传
品。橄榄油为西班牙亿芭利橄榄油公司产品。
二、方法 １．标本筛选：痰标本经革兰染色、镜检，发现有
７个种…。近年来，随着分子生物学研究的进展尤其 是核糖体ＤＮＡ测序和随机扩增多态性分析在真菌 分型上的应用，又有皮肤马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｄｅｒｍａｔｉｓ）江１、马属马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｅｑｕｉ）Ｈ Ｊ、同 本马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、大和马拉色菌 （Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ）¨Ｊ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｎａｌ２ｚｚ［ｓｊ及
（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）、糠秕马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
面培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。触
酶试剂ＩＤ—ＡＳＥ、革兰染色液购自法国生物梅里埃公 司。派克标准墨水（Ｂｌｕｅ－Ｂｌａｃｋ ｉｎｋ）为上海派克笔 有限公司产品。蓖麻油为湖北科田药业有限公司产
ｆｕｏｒｕｒ）、钝形马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ）、球形马拉 色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ）、限制马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）和斯洛菲马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）
ｍｅｄｉａ）ｉｎ ｔｈｅ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｔ ３５℃．Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ｂｅｔｈ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ４０ ａｎｄ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ６０．Ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
相关，常侵袭皮肤角质层引起浅部真菌病。在已公 认的马拉色菌７个种中，糠秕马拉色菌较为常见，其
最常导致的疾病为花斑糠疹，糠秕马拉色菌还可引
菌株ＡＴＣＣｌ４５２１和球形马拉色菌ＣＢＳ ９７９５做质控 对照。 ４．形态学鉴定：取分离菌株涂片，用５００
ｍｌ／Ｌ
起败血症、腹膜炎、肺炎等【８］。本研究探讨了临床
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｓｍｅａｌ鸭．ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｏ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ
Ｔｏ
ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｉｌｌｆｕｒ
ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ
ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ．ｎｅｔｈｏｄｓ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｗｅｒｅ ａｌＳＯ ｉｄａｎｔｉｆｉｅｄ鹪Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｌｌ咖ｒ
ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｐａｒｋｅｒ ｊｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
ｍｅｄｉａ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ危币‘，Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ
ａ８
产生气泡则为阳性，不产生气泡为阴性。 ９．吐温沉淀试验：在加０．５％吐温４０和０．５％
吐温６０的ＳＤＡ培养基上观察马拉色菌的菌落周 围，如果出现白色沉淀圈，即为吐温沉淀试验阳性。 １０．蓖麻油试验：（１）打孔法：配制０．５麦氏浓
２％吐温２０、４０、６０、８０的ＳＤＡ，加０．５％吐温４０和
患者下呼吸道标本中糠秕马拉色菌的分离及鉴定
派克墨水染色后镜下观察形态为卵圆形出芽孢子。 ５．沙保罗培养基生长试验：将分离菌种接种于 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养１４ ｄ，记录生长情况。 ６．吐温试验：（１）打孑Ｌ法：配制０．５麦氏浓度待 检菌液，密涂直径９０
ｌｎｍ
情况。
材料与方法 一、材料 １．标本来源：标本采自２０１０年３月至２０１１年 ９月卫生部北京医院呼吸道感染患者的气管吸痰 ４５００份。直接涂片经革兰染色镜检，镜下找到形态 疑似马拉色菌为入选标准，剔除同一患者的重复标 本，共１３３份疑似标本。糠秕马拉色菌ＡＴＣＣｌ４５２１ 由四川省人民医院喻华老师馈赠，球形马拉色菌
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｃａｐｒａｅ【６ｊ
可疑为马拉色菌（革兰染色阳性、成群圆形或卵圆 形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结
构）的标本，另涂片作派克墨水染色，镜检确认（念 珠菌孢子不着色）后接种马拉色菌筛选平板。 ２．菌株分离培养：挑一环镜检阳性的标本接种 于吐温科玛嘉平板上，用接种环密涂，于３５℃大气 环境，孵育２ ｄ开始观察。挑取小圆。白色至粉红 色，突起，较干燥，有特殊芳香气味的菌落涂片，用派 克墨水染色后镜检，疑似菌株在加０．５％吐温４０和 ０．５％吐温６０的ＳＤＡ平板上进行纯培养。孵育至