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2.4细菌生化反应鉴定
• 2.4.1糖发酵试验。用接种针分别挑少许紫黑色和粉红色的细菌接 种到葡萄糖发酵微量管和乳糖发酵微量管中，将微量管放在平皿 盖内，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。 • 2.4.2细菌药物敏感性试验。接种环分别取紫黑、粉红色两种菌液 3～6ul×2环，各自在两个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱 窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约 15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸 片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。 37℃18～24小时培养，观察结果。 • 2.4.3半固体接种法。接种针斜面取紫黑和粉红色的细菌，各自接 种进两个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达 培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37℃下,培 养24小时，观察结果。 • 2.4.4 痢疾血清玻片凝集反应。取载玻片1张，滴加痢疾血清和生 理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落， 各自与上述混合液液滴混匀，观察结果
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3.实验结果
• 3.1细菌在固体培养基上生长特征的观察。 • 将粪便标本用平半分区划分法接种于伊红 美兰培养皿上，培养出紫黑色和粉红色两 种菌落。(见图一)
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• 3.2革兰染色镜检。 • 取紫黑色和粉红色菌涂片，革兰染色，进 行镜检。紫黑色菌革兰染色阴性，长杆状。 粉色菌革兰染色阴性，短杆状。（见图二， 图三）
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2.2细菌的分离与培养
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• • • •
2.2.1采用平板划线分离法，将取粪便标本中混杂的多种细 菌，在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细 菌，在37℃培养24h，从而分离出肉眼可见的单个菌落。 2.2.2细菌在固体培养基上生长特征的观察。观察形成菌 落的大小、形状、边缘、表面、溶血性、色素、透明度、 湿润度。 2.2.3细菌的纯培养。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑 色、粉红色两种菌落。挑选这两种不同菌落分别在斜面培 养基上接种，标记，在37℃培养18h。 2.2.4细菌在斜面培养基上生长特征的观察。观察细菌的生 长量、菌苔形状、表面形状、光泽、透明度、颜色等。 2.2.5液体培养基接种法。用接种环在固体或斜面培养基上 挑选紫黑色和粉红色菌苔少许移入液体培养基管中，在接 近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液 混合于培养基中，混匀。在35℃培养4~6h，观察细菌的生 长情况
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2.3细菌个体形态特征的观察
• 2.3.1取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水3～ 4ul，2滴，在斜面培养基上取紫黑色菌苔少许 （1mm小菌落的半量）与第一块玻片上的一滴盐 水混匀，再取粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半 量）与第二块玻片上的一滴盐水混匀，涂成1cm2； 做好标志。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其 进行固定。 • 2.3.2革兰染色。用结晶紫对以上两块已固定的玻 片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分 钟，水洗；然后用95％乙醇对其进行脱色约20秒 钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸 干，在显微镜下镜检。
实验目的
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目 的菌的不同而选择培养基，以利于病原菌的检出。 而且，因其各种正常菌群含量甚多，仅以染色性 和形态无法分辨是否为病原菌。常见的病原菌有 志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。 这次实验中我们从粪便标本中检出的是大肠 埃希菌、痢疾志贺菌。而且，我们从这次的综合 性实验中了解到了医学微生物学主要的研究方法 和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原 理，树立了牢固的无菌观念。同时培养了我们的 动色 单染色 需氧培养 厌氧培养 微需氧培 养及特殊 培养
增菌培养
直接分离
动力观察及制动 试验 碱性胨水 增菌液 SS平板 碱性平板分 离 菌落形态 菌落形态 抗血清凝集 生化反应 副溶血性弧菌选 择性平板 菌落形态生化 反应
抗血清凝集 初步结果报告 生化反应
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实验结果
1.实验材料
• 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普 通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林 巴斯CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、 玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细 菌干粉培养基（营养琼脂、营养肉汤、半固体琼 脂）、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵微量管 （葡萄糖、乳糖）、灭菌平皿、试管（棉塞）、 刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、 橡皮筋、尺子、药勺、革兰氏染色液（结晶紫染 液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红）、 小砂轮、痢疾血清、青霉素、链霉素、庆大霉素 和生理盐水滤纸片、线绳、香柏油、擦油纸
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2.实验方法
• 2.1培养基的制备、消毒和灭菌 • 培养基制备的一般程序： • 调配→溶化→ 矫正pH →分装→灭菌→检定→保 存。 • 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→ 检定→保存。 • 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放 在试管筐里，然后罩上硫酸纸，牛皮纸，用橡皮 筋扎好 →放入讲台边的高压灭菌桶或高压灭菌筐 内→送到高压灭菌室（洗刷室）。
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• 3.3糖发酵实验和半固体培养基实验。 • 紫黑色菌两支单糖发酵微量管均变色和产 气，粉红色菌葡萄糖发酵管变色不产气泡， 乳糖发酵管既不变色也不产气泡。半固体 实验中，紫黑色菌成模糊状，粉色菌成清 晰的线状。（结果见图四，图五，表二）
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• 表2、糖发酵试验和半固体培养基实验结果
细菌种类 紫黑色菌 粉红色菌 葡萄糖 ⊕ + 乳糖 ⊕ 半固体 + -
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表1.培养基的制备
组号 培养基 称量(g) 水量(ml) 煮沸(次) 分装(ml) 备注(24人分)
1 营养琼脂
2,3 营养琼脂 6 营养肉汤 7,8 半固体
11.4
2.9 2.0 1.5
300
75 90 50 3 1 3 5 3 3
3瓶，500ml瓶，平板
15支，中试管，斜面 30支，小试管，液体 15支，小试管，高层