Northern blot：是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA 通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。

它是研究基因表达的有效手段。

与Southern blot 相比，它的条件更严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。

实验步骤：1.用具的准备2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染3．制胶4. RNA样品的制备5.电泳6.转膜7.探针的制备8.探针的纯化及比活性测定9．预杂交10．探针变性11．杂交12．洗膜13．曝光14．去除膜上的探针15．杂交结果半定量PCR要求比普通PCR更严格一些，另外往往通过转膜后的同位素杂交检测或凝胶成像后的灰度测定比较样品间的差异。

半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如β-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个β-actin的内参照对照。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1．实时荧光定量PCR无需内标2．内标对实时荧光定量PCR的影响Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法）检测两种蛋白质相互作用方法1共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析2蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。

被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。

3免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。

缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。

另外灵敏度不如亲和色谱高4 Far-Western 又叫做亲和印记。

将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。

缺点是转膜前需要将蛋白复性。

1.酵母双杂交2.GSTpull-down实验3.免疫共沉淀4.蛋白质细胞内定位RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法1.此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息2.节约了实验所花费的经费和时间。

3.只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果注意事项1.cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高2. RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

3.在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动4.重叠引物的设计会对全长的产生有帮助5.引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端6.降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。

在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。

随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

步骤cDNA第一条链的合成 cDNA第二链的合成图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息，而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。

实现突位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。

步骤：1.构建遗传作图群体2. 基因初定位3. 基因精细定位4.功能互补验证酵母双杂交：基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain，DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域酵母双杂交模型.DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合. 而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录.原理：二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenc 利用酵母双杂交筛选基因，而GAL4-ad没有。

因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。

常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中。

酵母单杂交技术通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。

由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。

酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA 结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。

其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。

理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。

肽链合成后加工内容肽链在核糖体上合成后，进一步形成蛋白质时往往要进行加工，在加工时常常要切去一部分氨基酸，再构成蛋白质。

现有一条含100个氨基酸的肽链，其中含游离的氨基14个，加工时共切去氨基酸16个，则加工后多肽链所含的游离氨基至少还有1个。

1．多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质：分子伴侣（热休克蛋白，伴侣素），蛋白二硫键异构酶，肽－脯氨酰顺反异构酶。

2．一级结构的修饰：肽链N端的修饰，个别氨基酸的共价修饰，多肽链的水解修饰。

3．空间结构的修饰：亚基聚合，辅基连接，疏水脂链的共价修饰。

4．蛋白质合成后的靶向输送：分泌性蛋白的靶向输送（信号肽，信号肽识别颗粒，SRP对接蛋白），线粒体蛋白的靶向输送，细胞核蛋白的靶向输送（核定位序列）。

1．一级结构的加工修饰：⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。

其过程是：①去甲酰化；②去蛋氨酰基。

⑵氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。

⑶二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。

⑷肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。

2．高级结构的形成：⑴构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下，形成特定的空间构象。

⑵亚基的聚合。

⑶辅基的连接。

3．靶向输送：蛋白质合成后，定向地被输送到其执行功能的场所称为靶向输送。

大多数情况下，被输送的蛋白质分子需穿过膜性结构，才能到达特定的地点。

因此，在这些蛋白质分子的氨基端，一般都带有一段疏水的肽段，称为信号肽。

分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP 与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞。

DNA回环模型当pol Ⅲ全酶在DNA遇到一个裂口时核心复合体和滑动的“夹子”离开，然后在别的地方再和新的β亚基结合，表示在冈崎片段末端发生这种反应。