PCR 扩增
基因型分析
α地中海贫血的 基因诊断结果
地中海贫血基因诊断
PCR 扩增
缺失型突变检测PCR 反应条件为:95℃预变性5min， 98℃ 45s，66℃ 30s，72℃ 3 min，35个循环，最 后72℃延伸5 min。 非缺失型突变检测PCR反应条件为:94℃预变性5 min， 94℃ 60s，55℃ 30s，72℃60 s，35个循环，最后 72℃延伸5min。
地中海贫血基因诊断
基因型分析
将上述PCR扩增产物与膜条100℃ 变性10min，43 ℃ 杂交2h以上，洗膜，加入酶标抗生物素蛋白，再次 洗膜，加入酶底物显色，具体步骤按说明书进行操 作。杂交及显色完成后，观察膜条上的蓝色斑点， 若只有野生型探针处(N)显色，为该位点的野生纯合 子;若只有突变型探针处(M)显色，为该位点的突变 纯合子; 若野生型探针处(N)和突变型探针处(M)均 显色，为该位点的杂合子。
临
床 中间型地贫：(+(高F)／ +(高F) 、+／+)
类
型 遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbFα 2γ 2)
地中海贫血基因诊断
A.重型β 地中海贫血
患者不能合成β 链 α 链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改
变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。 组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增
杂交结果 判定
α地中海贫 血的基因 诊断结果
地中海贫血基因诊断
PCR扩增
抽取受检者EDTA抗凝血2ml，按试剂盒操作说明书提 取患者DNA,在A、B两管PCR反应液中分别加入提取的 DNA 2ul。PCR反应条件为:93℃预变性5min; 93℃变性30s,复性60℃ 30s,72℃延伸1min,35个循 环;最后72℃延伸5min。
杂交膜条上结合的14种ASO探针排列顺序见表1。 探针排列成3排,上排和中排分别对应8种常见突变位点 的野生型(N)和突变型(M)探针,下排分别对应显色反应 控制点,空白点和6种稀少突变位点的突变型(M)探针。 杂交及显色完成后,显色反应控制点呈边缘清晰的蓝色 圆点,否则需要重新检查杂交过程。所有的野生型(N) 显色,突变型(M)不显色为正常人;某一位点的野生型 (N)和突变型(M)均显色,为这一位点的杂合子;某一位 点只有突变型(M)显色,野生型(N)不显色,为这一位点 的突变纯合子;某两个位点的野生型(N)和突变型(M)均 显色,为这两个位点的双重杂合子。
地中海贫血基因诊断
α 地中海贫血的基因诊断结果 样本基因型 缺失型和非缺失型α －地贫基因突变检测结果见图1和图2。
图2 非缺失型α－地贫基因突变检测结果
图1 缺失型α－地贫基因突 变检测结果
地中海贫血基因诊断
β 地中海贫血的基因诊断步骤
PCR 扩增
反向点杂交( reve rse do tb lo t, RDB)
参考文献
[1]《地中海贫血88例基因诊断结果分析》 [2]《地中海贫血的基因诊断技术研究》 [3]《地中海贫血诊断与基因分型》 [4]《贵州地区_地中海贫血基因诊断》 [5]《遗传病的基因诊断和治疗》 [6]《医学遗传学理论与实践_5_遗传病的基因诊 断和治疗》 [7]《遗传病的基因诊断与治疗研究进展》 [8]《孕妇地中海贫血的产前筛选与诊断》 [9]《在日本研究肿瘤的基因诊断与治疗》
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地中海贫血基因诊断
地中海贫血
1
地中海贫介绍
2
发病机制
3
基因诊断和治疗
地中海贫血基因诊断
“地中海贫血症”来源
1925年,Cooley描述了一个幼儿患有贫血,并伴发有 有核红细胞增多症.此后,意大利,希腊等地中海区域 也陆续发现并报道类似疾病,因该病首先在地中海区 域发现,因此被称为地中海贫血.(thalassemia).
地中海贫血基因诊断
α地中海贫血(α地贫)的类型
名称
Bart’s 水肿胎儿综合征 HbH 病 标准型
静止型 正常
基因型 a 0/a 0 a ＋/a 0 a A /a 0 a ＋/a＋ a A/a ＋ a A /a A
缺失基因 ―― /―― α ― /―― α α /―― α ― /α ― α α /α ― α α /α α
珠蛋白基因的结构及表达
1.珠蛋白基因的结构
α 珠蛋白基因簇 16p13 β 珠蛋白基因簇 11p15
地中海贫血基因诊断
地中海贫血的分型
·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将
其分为4种类型。
·β地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类
型： ·重型地中海贫血 ·中间型地中海贫血 ·轻型地中海贫血
α地中海贫血的分子机制
基因缺失：缺失型α 地中海贫血
基因突变：非缺失型α 地中海贫血
地中海贫血的分子机制
基因缺失 基因突变
编码序列突变； 转录调控序列突变（TATA box)； RNA加工和修饰信号序列突变（GT-AG接头）
地中海贫血基因诊断
地中海贫血基因诊断
地中海贫血基因诊断
α地中海贫血的基因诊断步骤
地中海贫血基因诊断
地中海贫血症介绍
地中海贫血(THAC)是一种较为常见的单基因遗传
性疾病，多出现在我国的南方各省，又以海南及两 广沿海地区多发。 其主要致病机制为α 珠蛋白或β 珠蛋白基因出现缺 失或具有缺陷，从而引起血红蛋白中不同肽链出现 合成比例失衡，进而导致了溶血性贫血疾病的发生。
地中海贫血基因诊断
3个α 缺失→β 4
高氧亲和力→组织缺氧 H包涵体→溶血→贫血
地中海贫血基因诊断
C. 标准型α地中海贫血 （α0/αA或α+/α+） D. 静止型α地中海贫血（α+/αA）
地中海贫血基因诊断
β珠蛋白生成障碍性贫血
重型地贫：(0／0 、+／+、0／0 )
地 贫
轻型地贫：(0／A 、0／A、0／A )
地中海贫血基因诊断
反向点杂交( reversedot-blot, RDB)
将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42℃杂 交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜, 加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进 行操作。
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
C.轻型β 地中海贫血
发生于β 0或β +地中海贫血基因的杂合子，无 任何临床症状。
地中海贫血基因诊断
D.遗传性胎儿血红蛋白持续增多症
HbFα2γ2 遗传缺陷导致δ 和β 基因表达受到抑制，而γ 链 合成却异常增高，使成人红细胞内的胎儿血红蛋 白HbF持续增多。
地中海贫血基因诊断
地中海贫血的分子机制
地中海贫血基因诊断
β 地中海贫血的基因诊断 5 种突变等位基因
地中海贫血基因诊断
关于基因治疗的展望
不久的将来,人类可望在基因的分子结构上自 我认识,了解人体内60兆个细胞中的约10万个基因 以及它们的特征和功能,这样影响人类健康的所有 疾病均能作预防基因治疗,我们期待着这一天的早 日到来。
地中海贫血基因诊断
地中海贫血基因诊断
生，骨质受损变得疏松，可出现鼻塌眼肿、上颔 前突、头大额隆等特殊的“地中海贫血面容”。
地中海贫血基因诊断
地中海贫血基因诊断
B.中间型β 地中海贫血
一般是β +地中海贫血基因的纯合子，患者 的基因型通常为β +（高F）／β +（高F）或β + ／δ β +。病人的症状介于重型和轻型之间，故 称为中间型。
缺失一个α基因——尚有部分α链合成者，α+地贫； 缺失两个α基因——α链完全不能合成者，α0地贫。
a 链的合成
0 25 ％ 50 ％
75 ％ 100 ％
地中海贫血基因诊断
A.Hb Bart’s胎儿水肿综合症
4个α 基因缺失→→α 珠蛋白缺失→→γ 4/高氧亲和力→→组织严重缺氧
地中海贫血基因诊断
B.血红蛋白H病（α0/α+）