ES细胞的分化抑制培养：
在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足 够的营养物质以满足其增殖的需要，另一 方面要抑制其分化，其中前者由基础培养 基来解决，后者则由分化抑制物来完成。
2012-9-6
分化抑制物的选择：
目前有三种分化抑制物比较常用：
饲养层（feeder layer） 条件培养基（conditioned medium，CM） 白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）
2012-9-6
• 胚胎生殖细胞的常规培养：每日更换培养 基，接种0d左右，选择鸟巢状并分化明显 的细胞集落，按照常规手工挑克隆的方法 选择并传代，或者使用Percoll液配制成细胞 分离液，常规消化后进行梯度离心，选择 含原生殖细胞最多的部分再进行分离，最 后接种在新的饲养层细胞上。
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2012-9-6
步骤：
• ⑴取2周龄Wistar孕鼠1只，处死，70%乙醇 消毒5min，剪开腹部皮肤打开腹腔，切取 子宫，转入无菌90mm培养皿中。 • ⑵眼科剪从子宫处取出胎鼠，D-Hanks液冲 洗，置冰台上，用眼科剪剪开头骨，小心 将脑组织移入另一无菌90mm培养皿中，DHanks液冲洗。
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步骤：
• ⑴获取胎鼠成纤维细胞（MEFs）:将雌鼠与 雄鼠合笼，次日见阴拴者记为0.5d，取 10~14d的胎鼠，去除胎胚头和内脏，无菌 PBS漂洗两遍，用眼科剪充分剪碎，转移到 50ml的离心管中，加入20~30ml细胞消化液 （PBS液，含0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA） 37℃轻轻震荡消化约30min，过200目细胞 筛，PBS离心漂洗2次，重悬细胞并接种， 按普通方法传代，冻存，备用。换液时收 集细胞上清液，4000r/min离心15min，过滤 后使用。
2012-9-6
小鼠胚胎干细胞的体外培养：
• 概述：小鼠胚胎生殖细胞是生殖嵴的原生 殖细胞，被认为具有胚胎干细胞的自我更 新能力和多能分化能力，因此可以被视为 胚胎性干细胞。
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用品：
• ⑴培养基试剂和用品：胎牛血清、新生牛 血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、bFGF（ 促有丝分裂因子）、Percoll细胞分离液、丝 裂霉素C、NBT/BCIP试剂盒、胰蛋白酶、细 胞培养用品和设备、玻璃吸管，显微外科 手术器械、倒置显微镜、解剖显微镜、普 通离心机等。 • ⑵实验动物：昆明小白鼠，8~10周龄，体 重30~35g。
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特点：
• ①干细胞本身不是终末分化细胞（即干细 胞不是处于分化途径的终端）； • ②干细胞能无限增殖分裂； • ③干细胞可连续分裂几代，也可在较长时 间内处于静止状态； • ④干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途 径中选择其一——或保持亲代特征，仍作 为干细胞，或不可逆的向终末分化。
• ⑵神经干细胞的冻存与和复苏与正常细胞 的操作流程相同。
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• ⑶去除脑膜及血管，用手术刀反复切割脑 组织，过200目筛，制成单细胞悬液。 • ⑷细胞计数，以10^6个/mL细胞密度接种于 塑料培养瓶中，加入条件培养基，37℃、 5%CO2饱和湿度恒温箱中培养。
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传代培养:
• ⑴神经干细胞的生长特点是悬浮生长，增 殖力强，6~7d传一代。一般一瓶细胞传成3 瓶培养。传代的操作细节及注意事项与悬 浮细胞的传代相同。
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成体干细胞：
• 成体干细胞包括：造血干细胞、骨髓间质 干细胞、神经干细胞、肌干细胞、成骨干 细胞、内胚层干细胞和视网膜干细胞等。
2012-9-6
Байду номын сангаас
神经干细胞的培养：
• 用品： • ⑴条件培养基：DMEM/F12=1:1、 20ng/mLbFGF（促有丝分裂因子）、 100ug/mL胰岛素。 • ⑵0.25%胰蛋白酶。 • ⑶D-Hanks液：NaCl8g、KCl0.4g、 NaHPO4· H2O0.06g、KH2PO40.35g、酚磺酞 0.02g，加水1000mL溶解，调PH值为7.2~7.4 ，高压灭菌，4℃储存。 • ⑷手术刀、弯钳、眼科剪、1mL注射器、手 术弯盘、青霉素小瓶、细胞计数板。
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胚胎干细胞：ES细胞
• 胚胎干细胞是一种经人工操作能够发育成 一个新个体的全能性二倍体细胞。它是从 早期胚胎内细胞团或原始胚胎生殖细胞经 体外分化抑制培养分离克隆的，二者的形 态、标志、体内分化潜能及种系传递功能 都相似。
2012-9-6
ES细胞主要特性：
• 1、ES细胞在不同条件下具有不同的功能状 态，它是饲养层细胞以来的。在有抑制因 子存在的条件培养基中，它呈未分化状态 生长；在无抑制因子存在的培养基中，分 化成各种细胞；在悬浮培养时，可形成胚 状体。 • 2、ES细胞具有分化成各种类型细胞的多潜 能性，此种特性既可以在体内发育，也可 在体外诱导。
干细胞培养
细胞培养：
• 概念：在体外模拟体内的生理环境，培养 从机体取出的细胞，并使之生存和生长的 技术称为细胞培养
2012-9-6
体外细胞培养的条件：
• 体外细胞培养必须注意三个环节：营养、 生存环境和废物的排除。
• 体外培养细胞所需的营养是由培养基提供 的。 • 体外培养必须模拟体内细胞生长的环境。 环境因素主要是指无菌环境、合适的温度 、一定的渗透压和气体环境。
2012-9-6
• ⑵MEF饲养层的制备：取80%融合的MEFs， 加入10ug/ml丝裂霉素C，在CO2孵箱中孵育 2H，加入细胞消化液，再用饲养层细胞培 养液中和并吹打成单细胞悬液，调整细胞 密度到4x10^5个/ml，在六孔板中每孔加入 3ml，置CO2孵箱中待用。
2012-9-6
• ⑶获取胚胎生殖细胞：取10d的胎鼠，在解 剖显微镜下借助显微外科器械，于其腰骶 部寻找并分离生殖嵴，再转移到胰酶中， 用细口径吸管吹打，把生殖嵴消化成单细 胞悬液，以0.5个胚胎/孔转移到饲养层细胞 上，加入胚胎干细胞培养液（a-MEM，10% 胎牛血清，1mmol/L丙酮酸钠，2mmol/L非 必需氨基酸，2mmol/L左旋谷氨酰胺， 100U/mL，bFGF）置于CO2孵箱中。
2012-9-6
概述：
• 干细胞是一种自我更新、高度增殖以及多种分化 潜能的未分化细胞。各种功能细胞的生成及其调 控依赖于各种微环境、细胞生长因子、基质细胞 、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，并 涉及有关细胞增殖、分化、迁移、定居、衰老、 凋亡、癌变等许多生命科学中的基本机制。
2012-9-6
来源：
• 干细胞有多种来源，根据其来源的种属可以分为 人干细胞、小鼠干细胞、牛干细胞、猪干细胞、 大鼠干细胞等；根据其来源的部位可以分为胚胎 干细胞、造血干细胞、骨髓基质干细胞、神经干 细胞、肝干细胞、生殖干细胞、胰腺干细胞等。
2012-9-6
分类：
• 干细胞有两种分类：一是根据干细胞所处 的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞 。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜 能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和 单能干细胞。胚胎干细胞的发育等级较高 ，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等 级较低，是多能或单能干细胞。