植物组织MDA 含量测定
一、目的要求
1．掌握植物组织MDA 含量测定的原理及具体测量步骤；
2．深化理解MDA 与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA 含量测定的意义； 3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA 形成的关系；
4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA 含量； 5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

二、实验原理
植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。

活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。

其中丙二醛（Malondialdehyde ，MDA ）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。

因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一个常用指标，可通过测定MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA 在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA ）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet —nine ），又名三甲川，该物质在532nm 处有最大光吸收，在600nm 处有最小光吸收。

由于TBA 也可与其它物质反应，并在532nm 处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm 下的吸光度，利用532nm 与600nm 下的吸光度的差值计算MDA 的浓度。

即：A 532－A 600＝ε·C ·L
式中，A 532和A 600分别表示532nm 和600nm 处的吸光度值，C 是MDA 浓度，L 为比色杯厚度，ε=155L·mmol -1·cm -1。

+
100 C
O
H N S
N H
O
O O
H
H
H N
H S
N
H
O O
H O
OH
N
N H
S
2O
TB
A MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮
需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA 反应有干扰作用。

可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C（μmol·L-1）=×(A532－A600) －×A450
三、材料与设备
1．材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。

2．仪器：
(1) 分光光度计；(2) 冷冻离心机；（3）水浴锅；(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；
(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。

3．药品
(1) L 磷酸钠缓冲液；(2) 5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；(3) ％的TBA溶液：称取硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml。

四、实验步骤
1．MDA的提取：取样品（W），加入2ml预冷的L 的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。

4500rpm，4度，离心10min，上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积（V）。

2．MDA含量测定：吸2ml（V2）的提取液于刻度试管中（空白为2ml缓冲液），加入3ml ％的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。

到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。

4500rpm，4度，离心10min，取上清液并量其体积（V1）。

上清液于532nm、600nm波长下测定吸光度。

3．结果计算:
MDA(nmol·g-1)＝×(A
532－A
600
) ×
W
V2
V
1
V
⨯
⨯
式中，V
1为反应液总量（ml）；V
2
为反应液中的提取液数量(ml)；V为提取液总量
（ml）； W为植物样品重量(g)。

五、实验报告?
六、思考题
1．TBA为什么要溶解在三氯乙酸中
2．提取液与TBA的混合液为什么要加热为什么加热时间又不能过长3．为什么要测定反应液在600nm下的吸光度
4．如果可溶性糖含量影响MDA含量的测定，你有什么办法消除其影响5．正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。

七、注意事项
1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。

2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为nmol · L-1）。

3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。