2.2.2 双向琼脂扩散. 用抗原抗体的同一琼脂介质中作相对扩散的 一种方法，即将抗原抗体加入不同 的小孔内，置湿盒内使其扩散，一 定时间后可观察是否有沉淀线，沉 淀线数目及其相互关系。此法需时 长，灵敏度较低，但特异性较高， 常用作定性测定。 2.2.3 对流免疫电泳. 这是双向扩散 与电泳技术结合一种方法。在Ph8-8.6 的缓冲溶液中，蛋白质抗原带负电荷， 可由阴极移向阳极。抗体虽然也是蛋 白质，但其等电点比抗原高，所带阴 离子就少；加上其分子量较大，移动 速度缓慢。同时因电渗作用，抗体反 ①Ag为阳性；②Ag为弱阳性； ③Ag为强阳性 ④Ag为强阳性 而向阴极泳动。所以在电场作用下，
酶的有效竞争抑制物，可阻断嘌呤碱的从头合成途径，使得骨髓瘤细胞不能在这种培养基 中合成DNA而避免其过度生长繁殖。而杂交瘤细胞由于可从免疫脾细胞中获得次黄嘌呤—鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶-HGRPT和胸苷激酶-TK，因而可通过另一途径(或称之为补救途径)利用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸，而在HAT培养基中存活，且大量繁殖。］
抗原向阳极泳动，抗体向阴极泳动，于是就形成了对流。该法灵敏 度比双向扩散高10-15倍，但其特异性不及双向扩散。现已有用于 HBsAg和甲胎蛋白(AFP)的初筛。 2.2.4 免疫电泳. 先将抗原在琼脂平板作电泳处理，然后再进行双 向扩散作用的一种分析方法。 抗原样品中各成分按泳电率 和泳动方向的不同而得以分 开；然后在与电泳方向平行 的琼脂槽中加入相应的抗血 清进行双向扩散。此时抗原 抗体会在浓度比例适合的地 方形成可见的沉淀弧。若将 其与已知的抗原抗体所形成 的电泳比较，就可以分析样
体的先决条件(反过来，所得到的抗体又可以纯化和检测抗原)。抗 原以不同形式和方式刺激机体免疫系统产生以抗体为主的体液免疫 应答或以细胞毒为主的细胞免疫应答。抗原种类繁多，但依其物理 性状可分为颗粒性和可溶性抗原两类。颗粒性抗原多为微生物细胞 (或病毒粒子)；其制备相对简单，一般用新鲜细胞经无菌生理盐水 或磷酸缓冲液洗涤后，配制成一定浓度即可。若是细菌H-抗原，则 还需用0.3-0.4%甲醛处理；细菌O-抗原需经100℃加热2h处理后应 用。 1. 动物抗血清(多克隆抗体)的制备 制备动物抗血清涉及到免疫使用的抗原、实验动物、佐剂以及 免疫方法等诸多因素；免疫所用抗原剂量与抗原种类、动物、免疫 周期及所要求的抗体特性等有关。抗原剂量过低不能形成足够强度 的免疫刺激；抗原剂量过高又有可能造成免疫耐受。 供免疫用的实验动物常有家兔、羊，马匹常用于制备大量抗毒 素血清，豚鼠较适于制备抗胰岛素抗体和供补体结合试验用抗体。
用多孔培养板培养二周左右，在有杂交瘤生长的孔内取上清液检 测有无特异性抗体；对有抗体产生的孔内的杂交瘤进行进行有限稀 释以克隆细胞。重复数次以保证抗体确由单克隆细胞所分泌。
第二节 抗原抗体反应原理 体外的抗原抗体反应被称为血清学反应；抗原抗体结合时可因 抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而会出现各种反应现象 。 1.抗原抗体结合具有特异性. 一种抗原分子只能与由它刺激机体所产生的抗体结合而发生反 应；抗原的特异性取决于其抗原决定簇的数目、性质和空间构型。 抗体的特异性则取决于Ig的Fab段可变区与相应抗原决定簇的结合能 力；但是这种结合不是以共价键方式，而是通过较弱的短距离引力 方式，如范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。 2.抗原抗体结合为可逆的化学反应 抗原抗体结合具有高度特异性，且有相当稳定性；但是为可逆 反应。因为两者属非共价结合，可在一定条件下解离；两者结合的 强度在较大程度上取决于抗体Fab段与抗原决定簇主体构型的吻合度 ，若二者适合性良好，则结合紧密，此抗体就称为高亲和力抗体； 反之就是低亲和力抗体。解离后的抗原抗体性质不变。
品中所含成分。该法的优点是样品用量少，特异性高，分辨力强； 但敏感性略差。主要用于分析抗原、鉴定提取物纯度、研究抗体组 成的动态变化等。 2.3 免疫标记技术 指用荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质标记抗体或抗 原而进行的抗原抗体反应。其优点在于特异、敏感、快捷，可定量、 定性，且易于观察。 2.3.1 免疫荧光技术(或荧光抗体法). 用荧光素与抗体结合成荧光 抗体进行抗原抗体反应。该技术由Coons(1942年)首创，常用的荧光 素有异氰酸荧光素和罗丹明［9-(2-Carboxyphenyl)-3,6-bis(diethylamino)xanthylium chloride］。荧光抗体仍然具有结合抗原的活性，结果可用荧光显微镜 检测。荧光免疫技术可分为直接法和间接法及补体法。 ●直接法. 将荧光抗体直接加在已经固定于载片上的标本(组织切 片或涂片)上，作用30分钟，洗去未结合的荧光抗体，干燥后镜检。 该法特异性高，但对于不同抗原均需制作相应荧光抗体(目前已少 用)。
子个体中有两个拷贝。在它们的组织中产生具有感染力的病毒，90% 的小鼠在10月龄之前就可产生。由胸腺形成的淋巴瘤。单抗制备采 用其B-细胞和骨髓瘤细胞。… 诱导细胞融合可采用生物学(仙台病毒)、物理学(电场、激光诱 导)和化学(聚乙二醇、溶血卵磷脂)的方法；融合后再利用HAT培养 基选择培养(H-次黄嘌呤，A-氨基喋呤，T-胸腺嘧啶)或代谢缺陷补救机理筛选 出杂交瘤细胞。［HAT培养中的氨基喋呤在化学结构上与叶酸非常相似，是叶酸还原
效价(滴度)。如，ABO血型试验(玻片凝 集试验)诊断伤寒、副伤寒的肥达试验 (试管凝集试验)均属此类反应。 1.2 沉淀反应. 可溶性抗原与相应抗 体在一定条件下出现可见沉淀的现象。 反应中的抗原称为沉淀原，抗体称为沉 淀素。沉淀反应也可在试管或玻片上进 行；在试管中进行时，在小口径试管内 先加入已知抗血清，然后小心加入待测 抗原于血清层上形成分界清晰的两层。 反应结果为阳性时，可于数分钟后在两 层液面交界处出现白色的沉淀环，此试 验称为环状沉淀反应。沉淀反应常用于
根据抗原不同及实验要求，抗原注射信息系统可采用皮下、皮 内肌肉、静脉、腹腔、淋巴结内等不同途径。初次免疫后需经过一 段时间(3-4周)可进行再次或多次免疫，这样可以保持高水平抗体 生成。在免疫加强最后一次注射后的一周内可以采集血清。抗血清 提纯并检验合格后可经56℃30min灭活，再加入适当防腐剂，置低 温(-20℃)保存(可达数月或数年)。 2. 单克隆抗体制备 1975年，Koehler和Milstein 成功应用杂交技术将小鼠的免 疫脾与小鼠的骨髓瘤细胞相融 合，由此产生的杂交瘤细胞传 承了两个亲代细胞的特点，既 保留了骨髓瘤细胞可以人工培 养且具无限增殖的特点，又具 有淋巴细胞(已致敏)合成分泌 特异性抗体的能力。
2.1.2 间接凝集抑制试验. 将可溶性 抗原先与相应抗体混合，然后加入用抗 原致敏的载体颗粒；由于抗体已经与可 溶性抗原结合而不能再与致敏颗粒上的 抗原发生间接凝集，故称之为间接凝集 抑制。不发生凝集结果者为阳性，反之 就是阴性。临床上的乳胶妊娠试验即为 此法。若用红细胞作致敏载体，则称为间接凝血和间接凝血抑制试 验。 2.1.3 反向间接凝集试验. 将抗体吸 附于载体颗粒上以检测抗原的反应。此 法对检测抗原有较高敏感性，多用于对 传染病和肝病的早期诊断。如是用红细 胞作载体时则称为反向被动凝血反应。
1.4 中和试验. 抗体使相应抗原的毒性或 传染性消失的反应称为中和试验。临床上 可用于检测风湿病患者体内的抗链球菌溶 血素O抗体。
2.现代抗原抗体反应 2.1 派生于凝集反应 2.1.1 间接凝集反应. 将可溶性抗原吸附 或偶联于无关颗粒上，使其成为致 敏载体颗粒，然后再与相应抗体结 合并出现凝集现象，这就称为间接 凝集反应。常用的无关载体颗粒包 括Rh-/O型人红细胞、动物红细胞、 浓度应适当
抗原抗体相遇时，只要是相对应的， 无论比例浓度如何都会很快发生特异性结 合。但是，只有在一定浓度和二者分子比 例适合时过境时才会出现(肉眼)可见的反 应，如沉淀反应、凝集反应中产生的沉淀 物和凝集块。只要二者比例适当，就可产 生沉淀和凝集块且量大；否则就产生很少 或无法产生沉淀和凝集块。抗原抗体特异 性结合一般可在几秒钟内完成，但要出现可见反应则受到一定条件 影响，除浓度比例外，还需一定的pH、温度、电解质、补体等。出 现可见反应所需时间范围变化较大，短之以秒计，长者以时计甚至 过夜。 4.交叉反应 抗原(抗体)除可与其相应抗体(抗原)发生特异性反应外，还可
第七章 抗原抗体反应
授课要点： 1. 抗原抗体反应原理 2. 常见的免疫分析方法
免疫应答的最终结果是免疫应答效应物与抗原性异物相互作用， 其结果或是保护机体免遭抗原性异物的损伤(生理性)，或是对自身 组织器官造成损伤(病理性)。免疫效应物包括抗体、致敏淋巴细胞 、补体及其某些细胞因子。由于抗体存在天血清或组织液中，抗原 抗体特异性反应不仅可在体内进行，也可在体外进行；所以抗原抗 体反应就构成了利用血清学方法进行各种检测的基础。 第一节 抗体的制备 抗原抗体是血清学反应的物质基础，且对抗原特异性的抗体是 免疫应答的效应物之一。所以，抗原的获得与纯化是获得特异性抗
2.1.4 协同凝集试验. 用金黄葡萄球菌作为IgG的载体进行的凝集 反应。金黄葡萄球菌细胞壁成分中 的A蛋白可与人以及许多哺乳动物血 清中的IgG类Fc段结合，而IgG类的 Fab段则可与相应抗原结合而出现凝 集现象。此法已用于流脑、伤寒、布氏杆菌等的早期诊断。
2.2 派生于沉淀反应 2.2.1 单向琼脂扩散. 用抗原在 含有抗体的琼脂中自然扩散，在适 当浓度处会出现沉淀环的方法，这是一种定量试验。沉淀环的直径 与浓度成正比。若用不同浓度已知标样抗原作同样单向扩散并绘出 标准曲线，即可对样品所现沉淀环的直径查曲线得出其抗原含量。
试管凝集试验
环状沉淀反应
抗原的定性、法医学鉴定血迹、食品卫生学鉴别肉的种类等。反应 时若将抗原抗体充分混匀，一定时间后可出现絮状颗粒，此称为絮 状反应(检验梅毒的康氏试验即为此法，现已不多用)。 1.3 补体结合试验. 在补体 参与下，以绵羊红细胞和溶 血素为指示系统的抗原抗体 反应。整个试验包括补体和 待检系统以及指示系统。 该法的敏感性和特异性 较高，临床上用于检测梅毒 、L-链、免疫蛋白、抗DNA 抗体、抗血小板抗体、乙型 肝炎表面抗原(HBsAg)…等。