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为什么验证？
• 5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：
不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法 的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上 清丸样品的质量差异。
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表5 七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 法 中和法 离心法
验证
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供试品中抗菌活性的去除
• 稀释法——降低供试品的相对浓度 • 薄膜法——利用体积差异分离 • 中和法——利用化学（生物）专属性灭 活 • 离心法——利用沉降系数差异分离
各方法组合运用，效果更佳！
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抗菌活性去除效果的检验
• 应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对 供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性 菌的回收实验），再按药典要求全面验证， 提高效率。
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选择敏感菌株
间接方法——文献、技术资料（可靠） 直接方法——预实验（体外抑菌实验） 参考选择： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。
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表6 同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果（1：200） Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200)
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为什么验证?
• 1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检 查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他 检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结 果的科学性，如鉴别、含量测定。 • 2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌 检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性 对照、阳性对照等等。
27 47 27
31 33 64
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怎么验证？
How?
• 利用供试品与微生物的差异，降低或消 除供试品的影响，通过模拟实验对降低 或消除效果加以检验。
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供试品污染微生物检查
供试品
前处理
稀释 溶解 分散 萃取 离心
• 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一 个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判 断没有影响。 • 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在 验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的 前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究 提高。 • 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤 其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
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2、方法验证实验的一般原则和程序
• 验证什么？ • 怎么验证？
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验证什么？
What？
• 微生物检验： 某种样品采用某种方法得到一个检查结果。
①供试品影响
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②方法的有效性
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验证什么？
一、方法验证实验的背景及程序
• 1、关于方法验证（背景） • 2、方法验证实验的一般原则和程序
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1、关于方法验证（背景）
《中国药典》2005版 国食监注〔2005〕234号“关于颁布和执行《中国 药典》2005年版有关事宜的通知” 国药典发〔2005〕98号“关于执行《中国药典》 2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关 问题的说明” 中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗 生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方 法及标准研讨会会议纪要”
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方法疑问实例——菌在何处？
• 离心集菌法：500r/min离心5min × × × r/min = × × × g？
表7 10ml菌悬液500r/min离心5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（cfu/mL）
金葡10-6 不离心菌悬液计数 离心管上部菌悬液计数 离心管中部菌悬液计数 离心管下部菌悬液计数 39 25 27 30 大肠10-6 23 23 20 21 铜绿10-6 47 62 40 49 枯草10-5 13 18 15 12 白念10-5 93 黑曲霉10-4 100
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为什么验证?
• 3）、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查 方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每 一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结 果判断没有影响。 • 4）、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性 菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判， 以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌 检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以 及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。
需前处理 样品
What？
①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。
有抑菌作用
去除抑菌作用
③验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对污 染菌生长、检出的影响。
不需前处理
②可以通过验 证实验判断
无抑菌作用
检查
图1 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节
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验证什么？ ——需要验证的重点环节