常规试剂配制和测定方法一、溶液的配制1. Mandels营养盐溶液（1000 mL）名称重量（g）硫酸铵（(NH4)2SO4）14磷酸二氢钾（KH2PO4）20尿素（H2NCONH2） 3硫酸镁（MgSO4·7H2O） 3氯化钙（CaCl2·2H2O） 4注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）名称重量（g）氯化钴（CoCl2·6H2O）硫酸锌（ZnSO4·7H2O）硫酸锰（MnSO4·H2O）硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

3. DNS试剂的配制（1000 mL）（1）取：3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5 g氢氧化钠（NaOH ）14.0 g充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min）（2）加入：酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0 g苯酚（在50 ℃水浴中融化）mL偏重亚硫酸钠（Na2S2O5） 6.0 g（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。

此溶液每月配制一次。

注意：倒入瓶中时要尽量装满！！4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。

最终试剂中含%（w/v）考马斯亮蓝G-250，%（w/v）乙醇，%（w/v）磷酸。

5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）名称分子量Mn 重量(g)柠檬酸（C6H8O7·H2O）210 210NaOH 40准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始）。

（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为）6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定（1）标准糖溶液的配制准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 ℃烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。

取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。

即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。

取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。

即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。

（2）标准方程的测定：①葡萄糖/木糖标准方程的测定取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液1 mL，DNS溶液3 mL。

100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。

以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。

以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。

（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）②酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。

以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。

以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。

（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）③酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖标准溶液mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，测定CMC酶活力），摇匀。

以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。

以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。

（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制注：Na2HPO4，Mr =；mol/L溶液为28.40 g/LNa2HPO4·2H2O，Mr =；mol/L溶液为35.61 g/LC6H8O7·H2O，Mr =；mol/L溶液为21.01 g/L二、酶活力的测定1. 滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,., et al,Pure & .,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1 μmol葡萄糖量的酶量。

测定方法如下：取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 × 6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。

（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项目1#2#3#4#5#6#7#稀释酶液（mL）0 酶解葡萄糖标样0.05 M柠檬酸缓冲液（mL） 1将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却后加水至50 mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550 nm波长下测定吸光度A值。

反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。

以、、、酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：2 mg葡萄糖滤纸酶活力=60min×(mg/μmol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。

备注：当加入mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2 mg葡萄糖时，按下式计算：滤纸酶活= ×（葡萄糖mg数）2.β-葡萄糖苷酶活力的测定方法一：葡萄糖氧化酶测定法按国际标准方法测定[Ghose,.,etal,Pure & .,1987,59,257-268]。

一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1 μmol底物即生成2 μmol葡萄糖的酶量来表示。

预先用0.05 M的柠檬酸缓冲液配制15 mmol/L的纤维二糖溶液（0.513 g纤维二糖/100 mL0.05 M的柠檬酸缓冲液，现配现用）（1）每个样品应做三个不同酶量估计β-葡萄糖苷酶活力（IU/mL）<取酶液量（mL）（2）加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：酶液量（mL）0.05 M柠檬酸缓冲液（mL）纤维二糖溶液（mL）样品适量1－酶液 1酶液空白 1 1 0纤维二糖空白0 1 1每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。

注意：纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。

（3）酶解反应：试管置于50 ℃水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟使酶失活，冷却至室温。

（4）加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液30 μL，加入显色剂mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取1 g/L葡萄糖标样30 μL，加显色剂mL，混匀；置于37 ℃水浴中，保温15分钟，取出。

（5） 测吸光度：505 nm ，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A 值。

1g/L 葡萄糖标样的吸光度为左右。

（6） 计算产生的葡萄糖mg 数：样 品 吸光度测得 酶 空 白 所含葡萄糖 = 2 × （mg ） 纤维二糖空白 1g/L 葡萄糖标样吸光度 样品实际产生的葡萄糖 = [测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]－[酶空白葡萄糖mg] × [酶液量mL] （mg ）注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。

（7） 作图：以log(酶液量mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg 为横坐标作图，求出生成1 mg 葡萄糖时对应的酶液量mL 。

（8） 计算β-葡萄糖苷酶活力：β-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL ）生成1mg 葡萄糖对应的酶液量（mL ）注：当加入1mL 酶液仍不能生成1mg 葡萄糖时，β-葡萄糖苷酶活力 = ×（葡萄糖mg 数）☆ 补充：葡萄糖含量测定采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。

葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R 1（缓冲液）和R 2（酶试剂），使用时将R 1和R 2等量混合。

葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。

测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。

测定方法如下：在测定管中加入30 μL 待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L 的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R 1和R 2等量混合的酶酚混合液，将各试管分别摇匀，置于37℃水浴中保温15min ，冷却至室温后，在7230分光光度计上于505 nm 下测定吸光度A 值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：葡萄糖含量（g/L ）= × 稀释倍数测定管吸光度 标准管吸光度方法二：采用pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）试剂测定（1）试剂的配制①50 mmol/L , pH 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200 mL）方法：mol/L柠檬酸mL + mol/L磷酸氢二钠mL②1 mol/L Na2CO3溶液（250 mL）称取：26.5 g Na2CO3溶解后定容至250 mL③ 5 mmol/L pNPG（分子量：）溶液的配制（100 mL）称取0.1506 g pNPG，用50mmol/L，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100 mL。