同型对照
荧光素直接与FcR结合
做多色分析时，要尽量选择荧光波谱重叠
较小的荧光染料进行组合。
荧光素的搭配
依据

流式细胞仪检测的通道数

需要同时检测的荧光抗体数
厂家提供的荧光素种类和数目

3. 仪器调整及数据获取

荧光补偿：指在流式细胞多色分析中，纠正荧
光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的 荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
Mean：平均荧光强度 Geo mean：几何均数 CV：细胞荧光变异细胞 Median：荧光强度的中值
Peak Ch：峰值道数
多参数分析-二维散点图
散 射 光 越 强 ， 细 胞 内 部 颗 粒 和 细 胞 器 越 多
与 细 胞 内 部 的 精 细 结 构 和 颗 粒 性 质 有 关
侧 向 角 ： 细 胞 通 过 测 量 90° 方 向 的 散 射 光 前向角：激光检测区正向收集的小角度散射光。 与细胞的大小和细胞表面光滑度有关。
临床检验诊断学研究生课程
流式细胞术
检验科
参考书

实用流式细胞术
北京大学医学部出版社 刘艳荣 主编

临床流式细胞分析
上海科学技术出版社 王建中 主编
教学目的

掌握流式细胞术的基本工作原理
熟悉流式细胞术的临床及科研应用 了解流式细胞术的质量控制


流式细胞术定义

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞 理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。

门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形
门、任意形状门和四象限门
分析

单参数分析 多参数分析 二维散点图 二维等高图 假三维图 三维图 多参数组合分析
单参数分析
Events：分析区域内的细胞数
M2 M1
%gate：门内细胞百分比
%total：检测细胞总数百分比
膜表面抗原染色-溶血-洗涤-透膜与固定（透膜 剂使用参照说明书）-细胞内抗原染色-洗涤-上 机检测

细胞内细胞因子检测
原理：通过细胞内蛋白分泌物抑制剂，阻断细
胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子
积聚在细胞浆中，增强了细胞因子信号。
刺激培养（刺激剂+阻断剂）-细胞表面抗原
染色-固定和破膜-细胞内细胞因子染色-洗涤-
散射光强，细胞大；反之，细胞小。
临床应用



淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞功能分析 血液病免疫分型 肿瘤耐药基因筛查 免疫缺陷病 自身免疫病 器官移植
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 流式细胞仪 显微镜
光源
对象 承载工具 检测信号 放大方式
激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路

肝素常用于白细胞功能研究，其可以更好的维 持细胞活性，放置更长时间，但是不适合血小
板的相关检测
2. 荧光染色
免疫荧光染色

细胞表面抗原标记
细胞内或核内抗原标记
细胞内细胞因子测定
细胞周期和DNA分析—应用比较少

细胞表面抗原标记
染色-溶血-洗涤-上机检测

细胞内或核内抗原标记
透膜剂的选择
结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速
测量并可分类收集的高科技产品。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核--特异性PH值, 膜电位 酶活性
基本工作原理
流式细胞仪的结构组成
荧光补偿的调节
荧光补偿

除去某一荧光素误入另一荧光通道的发射光信
号

荧光素的特性：某一种荧光素被任何通道上检
测的荧光信号的比值（如FITC被FL1和FL2检
测到的值）是恒定不变的。
4. 数据分析与报告

数据分析过程中，设门对于数据分析至关重要
某一抗原差异表达的细胞群 错表达细胞群
设门

设门：在细胞分布图中指定一个范围或一片区
实验技巧的掌握（刺激培养？膜分子丢失？破
膜？）

实验突发事件的处理能力（实验原理的掌握）
数据的处理与分析（百分数？荧光强度？凋亡 ？）
试验后 数据的处理与分析（***）
开始试验
1. 标本制备

外周血、采集物或骨髓：肝素或EDTA抗凝
组织细胞：单细胞悬液（机械法）
培养细胞：
体液：肝素抗凝
抗凝剂的选择

常用抗凝剂：EDTA、肝素、ACD
EDTA：同时可进行白细胞计数与分类，标本 48h内是稳定的； 肝素：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态
学观察
ACD：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态
学观察

骨髓标本优先选择肝素抗凝 EDTA适用于白细胞免疫分型分析，可以防止 成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失，且具有较 强的抗血小板凝集的能力；缺点：fsc特征丢 失较快
上机检测
荧光信号检测-荧光抗体组合

荧光信号强弱： PE>APC>PE-Cy5>PerCp-Cy5.5>FITC>PerCp
如何选择荧光抗体

荧光素的荧光强度
荧光素标记效率：
抗体检测抗原的密度：
自发荧光：自发荧光水平高的细胞，应使用
发射波长较长的荧光染料
（APC）
如何选择荧光抗体

非特异性结合

从基因水平进行验证？ 从蛋白水平进行验证？ 从细胞水平进行验证？ 功能研究？
复习题

流式细胞仪的分析检测原理是什么？
何谓荧光补偿？

FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解
读结果及其设门分析的意义？

流式细胞术有哪些临床应用价值？

激光及光束形成系统
液流系统
光信号收集系统
电子系统

数据的存储、显示与分析系统
流式细胞术检测的几个重要过程
试验前

实验目的与方法的选择 实验流程的熟悉（说明书） 标本的收集与保存 荧光抗体的选择与染色（是否需要同型对照？
空白对照？阴性对照？阳性对照？）
试验中

标本的处理
流式细胞术特点

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞 器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通
过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信
号对细胞进行定量分析或纯化分选。
流式细胞仪
是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分
析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起
来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部
自然光、灯光
细胞、组织等 载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大
统计
结果
计算机，>5000
多参数，综合分析
人工，200
简单，单参数
科研设计



研究目的明确 研究方法清晰 研究指标明了 研究结果预测 科研论文写作 实验前 框架 实验中 填补数据，图表 试验后 讨论
为什么要做流式细胞