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流式细胞术基本原理-(完整)


流式细胞仪分为四部分:
1)流动室与液流系统 2)光源与光学系统 3)信号收集、转换与分析系统 4)细胞分选系统
1)流动室与液流系统
2)光源与光学系统
激光(单色性、单向性)
前向散射(FSC)
侧向散射(SSC)
激发波长 发射波长
3)信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT),PMT 将光信号转换成电信号,电信号输入到放 大器放大。
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
流式细胞术流程
应用
• • • • • • • • 细胞膜:流动性、膜电位、膜通透性 细胞内离子浓度:H+、Na+、K+和Ca2+ 细胞周期:全周期分析、S期分析、M期分析 细胞表面蛋白质分析:免疫细胞分型、其他表面 蛋白分析 细胞功能:如凋亡、抗药性 基因表达:内源及外源基因表达 细胞分选 细胞克隆
流式细胞术的对照设置
阴性对照:调节荧光探测器合适的放大倍 数,将仪器归零,确定样本的基础荧光域 值 阳性对照:检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性 空白对照:不标记,自发荧光 PS:补偿对照:多色分析样本时为荧光光谱 重叠进行的的补偿调节
4)细胞分选系统
• 充电,带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
流式细胞术的基本原理
流式细胞术(flow cytometer,FCM):
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
流式细胞仪:是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
• 放大器分两类:线性放大和对数放大。 • 细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量 等的测量一般选用线性放大测量。 • 细胞膜表面抗原等的检测,由于表面抗原的 分布有时要相差几十倍,甚至几万倍,故取 对数放大。
光谱重叠与荧光补偿
• 实际中激发波长是正态或偏态曲线,荧光 素之间的波谱常有重叠,故流式细胞仪加 入了电子补偿系统,去除因光谱重叠而进 入其他荧光探测器的荧光信号,即荧光补 偿。
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