Basics of conventional fluorescence microscope
1 水银弧光灯 2 中密度滤片 3 光镧 4 场镧 5 激发滤片 6 分光镜（BSP) 7 物镜 8 样品 9,10 发射滤片 11 目镜
Fluorescent Microscope
Arc Lamp
Excitation Diaphragm-光圈 Excitation Filter
2）、球差： 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光
线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点 的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点 ,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不 清。
3）、色差： 是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜
色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透 镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像 模糊,而且像的边缘尚带有色晕。
3、显微镜成像清晰度的决定因素: 1）.分辨率 2）.球差 3）.色差
1）、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质 点分辨清楚的能力,通眼及各类显微镜的分辨率
人眼分辨率： 光学显微镜分辨率： 共焦显微镜分辨率： 电子显微镜分辨率：
0.20 mm 0.25 mm 0.18 mm 0.20 nm
2、共焦显微镜发展历史
• 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微 镜技术的某些基本原理，获得了美国的专 利
• 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦 显微镜产生了一个光学横断面
• 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光 与被照明物体的原子之间的非线性关系和 激光扫描器的拉曼光谱学
• 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜 大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特 点：需与扫描器连接，使激光能进入显微 镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到 达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与 激光转换，同时汞灯光线强度可调
（3）常用激光器
• 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有 单激光和多激光系统，常用的激光器包括 以下三种类型 :
1
2
2
观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平 面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图 像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生 物学标本是层次区别的重叠结构）。
共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域 被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区 域被照明。
（2）荧光显微镜系统
• 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统 的成像质量。显微镜光路以无限远光学系 统可方便地在其中插人光学选件而不影响 成像质量和测量精度。物镜应选取大数值 孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采 集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片 组的选取，载物台的移动调节，焦平面的 记忆锁定都应由计算机自动控制
• 半导体激光器：405nm（近紫外谱线 • 氩离子激光器：457nm、477nm、488nm
、514nm（蓝绿光 ) • 氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器
）633nm （红光—氦氖红激光器 )
• UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光 )
4）辅助设备
•风冷、水冷冷却系统及稳压电源
Ocular-目镜
Objective
Emission Filter
Confocal Principle
Objective
Laser Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Emission Filter Emission Pinhole
Differences between conventional and confocal microscope 1
从某种意义上讲，共聚焦显微
镜是一种现代化的光学显微镜，它 对传统的光镜从以下几方面作了改 进
• 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台 商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100 ，扫描方式为台阶式扫描
• 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作 生物荧光显微镜的共聚焦系统
• 1987年White和Amos在英国《自然》杂志 发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文 ，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要 工具
4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构
• 激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描 模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号 处理器、计算机以及图像输出设备等
激光共聚焦显微镜构成
显微镜 步进器
激光器 光电倍增管 检测器
计算机 电子图像 软件
（1）扫描模块
• 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片 的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播 方向）、发射荧光分色器（选择一定波长 范围的光进行检测）、检测器（光电倍增 管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫 描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色 器选择后，被分成各单色荧光，分别在不 同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦 图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个 并列的单色荧光图象及其合成图象
Laser Scanning Confocal Microscope
1、普通荧光显微镜的不足
使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的重叠结构）。
基本工作原理
• 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是 首先由激光器发射的一定波长的激发光， 光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光 栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平 面上，样品上相应的被照射点受激发而发 射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检 测器，并成像于计算机监视屏上。这样由 焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成 了一幅完整的共焦图像，称为光切片