• 5. 酶联免疫检测仪检测各孔OD值，检测波长570 nm, 以时间为横坐标， 平均OD值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线。 • 备注： A.选择适当的细胞接种浓度。因此，在进行MTT试验前，对每 一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲 线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不 致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关 系。 B.细胞生长曲线方法96孔板太小,接种细胞多时,用不了几天就长满,因 一般要做5-7天);接种细胞少时,不易养活.
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三瓶细胞均 铺满瓶底， 冻存两瓶， 剩下一瓶一 传三
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（A)细胞 仍有悬浮 细胞，背 景脏，拟 丢弃。
换液，细 细胞片状浮起，(A)仍有较 胞生长约 弃掉旧培养液，多单个细 胞漂浮， 瓶底70% pbs清洗后见 背景很脏 瓶底仍有少量 （小黑 细胞贴附，遂 点）,反复 将三瓶消化转 冲洗，换 液，见少 移至新瓶(A) 量细胞贴 继续培养。 附瓶底 预计周日 冻存两支， 再一传三 下午复苏 一支细胞 (B)
细胞生长曲线的绘制及注意事项
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用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，0.22微膜过滤除菌，4度保存。 (MTT溶剂需避光4度保存，配好的溶剂有效期两周，过期的不能再用 于实验，须重配)
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从第24 h开始，每隔24 h随机取1块96孔板，96孔板每孔加入20µl 5mg/mL MTT液，继续培养4 h后，吸出孔内培养液；向每孔加入 150µl DMSO。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物 溶解。
实验方法
• 细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的细胞，胰酶消化， 再加新鲜培养基制成细胞悬液后计数。 • 接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞，作 传代培养（接种七组，每组三孔）。 • 计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次， 连续计数7天。 • 绘图：根据计数结果，绘制细胞生长曲线。（横轴时间天 数，纵轴细胞数，万/mL）
微生物污染的检测 1，真菌的污染 真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲菌、黑曲菌、毛霉菌、孢子菌 白念、酵母等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉 眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见细胞之间有 纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝 在高倍镜下可见到有链状排列的菌株；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞 周边和细胞之间生长。有时通过显微镜观察可能发现瓶底外面生长的菌丝，不 要错当培养瓶内的污染。瓶外的污染物，需及时用酒精棉球擦洗清除，以防其 通过瓶口传入瓶内。
接种数不能过多也不能过少。太少细胞适应期太长，太多细胞将很快
进入增殖稳定期。一般接种量以7-10天能长满而不发生生长抑制为度。 同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，才能做纵向对比。
不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。
• 2，酌情每天或每隔一天取出三瓶细胞进行计数，计算均 值。一般每隔24h取一瓶连续观察1~2周或到细胞总数有 明显减少为止（一般需10天左右）。培养3~5天后常要给 未计数的细胞换液。 • 3，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在 半对数坐标纸上。连接成曲线即为该细胞生长曲线。
实验原理
• 一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜 伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止 生长，进入平顶期，然后退化衰老。 • 典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平台期及退化衰老四 个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期） 是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养 细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力， 而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。
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12日，三瓶细胞均铺满瓶底，冻了两瓶，剩下一瓶一传三，预计周五换液。 14日换液，细胞生长约瓶底70%，预计周日冻存两支，再一传三。 16日早晨去见细胞片状浮起，弃掉旧培养液，pbs清洗后见瓶底仍有少量细 胞贴附，遂将三瓶消化转移至新瓶(A)继续培养。 分析原因：1，周五细胞密度已经较大，应传代 2，细胞生长特别迅速（很多分裂相），加上密度大，周日情况 应是细胞密度抑制及代谢酸中毒。 17日上午见(A)仍有较多单个细胞漂浮，背景很脏（小黑点）,反复冲洗，换液， 见少量细胞贴附瓶底。 17日下午复苏一支细胞(B)。 18日见 (B)细胞部分贴附，换液，细胞较少； (A)个别细胞漂浮，背景 较脏。 19日见（B）细胞仍较少; (A)细胞变圆，少量漂浮，换液 20日见(B)细胞略有增多，见分裂相细胞。背景稍脏，预计明日换液 （A)细 胞仍有悬浮细胞，背景脏，拟丢弃。 分析原因：（A）虽然瓶壁有少量贴壁细胞，但状态应该也不好，加上消化， 所以转移至新瓶生长不好。
2，细菌污染 多见大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加用抗菌素的培养液一般可预防和排 除个别少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内颜色变 黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象，有时静置的培养液瓶初看不混，稍 加震荡就会有混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮， 有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停滞并有中毒表现。必要时可取少量 培养液涂片染色检查以正式细菌种类。有的培养液改变不明显又疑有污染，亦可向肉汤 培养基内滴入少量培养液，37下培养以检测。 细菌和霉菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅 速，多在发生污染48h以内就很明显。因而要在实验的最初两天密切观察试验样本是否 有污染发生，这样可以及时采取措施予以补救或排除。
结果分析
• 标准的生长曲线近似S形，一般在传代后第一天 细胞数有所减少，经过几天的潜伏适应期，进入 对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。 • 在细胞生长曲线上细胞数量增加一倍的时间称为 细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增 的时间区间即细胞对数生长期。细胞传代实验等 多在此区进行。
实验汇报
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简单地说：MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。 MTT主要有两个用途 1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性 的 测定； 2．细胞增殖及细胞活性测定。 MTT检测原理为: 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝 紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基 亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸 收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得 的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如 果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
细胞背景 脏，离心， 转移至玻 璃瓶培养
细胞污染，见黑 色线状物，移动， 疑细菌污染。培 养基清亮，未变 色，丢弃。
复苏另一 支CAL
换液
较多细胞贴壁， 背景脏
换液， PBS反复 冲洗，背 景稍干净
换液， PBS反复 冲洗。
细胞污染， 培养基浑浊。 镜下见培养 液中有大量 圆球状颗粒 漂浮。
微生物污染途径： 一，空气 超净台内操作，戴口罩，不大声讲话或咳嗽 （瓶盖拧紧再拿出温箱） 瓶盖拧松半圈，是否会造成培养瓶间污染的传染？ 二，器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底，例如洗刷不干净，污物残 留及培养液等灭菌不彻底都可引入有害物质。另外需注意CO2温箱，由于温箱 内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孳生。 而温箱是开放式培养，如不定期消毒，可形成污染。（进温箱前酒精喷手）
• 取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为 104~105个/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。 按200µl/孔（1×104个细胞）接种于96孔培养板内，每组细胞接种5 个孔，取平均值，切记各孔的接种密度一致。 • • 置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养
•(A)个别 (A)细胞变 细胞漂浮， 圆，少量 背景较脏。 漂浮，换 液
预计周五换 液。
(B)细胞部 （B）细 分贴附， 胞仍较少; 换液，细 胞较少
(B)细胞 略有增多， 见分裂相 细胞。背 景稍脏， 预计明日 换液
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B瓶细胞仍 较少，背景 脏（黑点， 不动），换 液
细胞生长曲线
康正强
概述
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生 长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和 非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲 线的测定一般可利用细胞计数法进行。
步骤
• 1，取生长状态良好的细胞，消化制成悬液。经计数后，精确地将细 胞分别接种于21~30个大小一致的细胞瓶里（常用10ml培养瓶，也可 用24孔培养板）每瓶接种细胞量要求一致，加入培养液也一致。细胞
3，支原体是大小介于细菌和病毒之间（最小0.2um）并独立生活的微生物，约有 1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁，形态多变，可为圆形、丝状或梨形。 多数支原体适合于偏碱性条件下生存（7.6~8.0）。对酸耐受性差，对一般抗生 素不敏感。 支原体污染后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著， 细微变化也可由于传代换液而缓解，因此易被忽视。但严重者可致细胞增殖缓慢， 甚至脱落。
细胞交叉污染防治 1，在进行多种细胞培养时，所用器具严格区分，标记。对每一种细胞按顺 序操作，避免一起进行时发生混乱。 2，进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及培养液瓶瓶口以免把细 胞带到培养液中，防止进行其他细胞培养操作时导致细胞污染。 3，所有从别处转来的细胞或自己所见的细胞系都要在早期留有充足的冻存 储备，一旦怀疑发生细胞交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定。如发现原 有标志性遗传物发生改变，可以复苏早期冻存细胞使用。