生物技术制药第一章绪论药学一级学科分类:药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类:治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类:细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物✦按生化特性分类:多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性:相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性:药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性:质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点:结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性:蛋白类药物安全性担忧的性质和来源;受试物的纯度;相关动物的选择;给药剂量的选择;免疫原性;遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验);药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题:生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题:药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷:生物利用度低,半衰期短;异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段:培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具:目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果:5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时,完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素:♦DNA样品的纯度:♦DNA的甲基化程度:核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。
♦酶切反应的温度♦DNA的分子结构♦反应缓冲液组成♦反应时间、反应体积等➢工具酶✦核酸限制性内切酶:识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。
主要存在于原核微生物中。
•同裂酶:指来源不同,识别序列相同的酶;进行同样的切割,产生相同的末端•同尾酶:来源不同,识别序列不同,但产生相同的粘性末端DNA甲基化酶:具有宿主专一性,对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰,避免被自身限制性内切酶水解✦DNA连接酶•T4噬菌体连接酶:连接双链DNA切口,或带粘性末端或平头末端的DNA片段•大肠杆菌DNA连接酶:连接双链DNA切口,或带粘性末端的DNA片,不能连接带平头末端的DNA 片段✦聚合酶:以DNA或RNA为模板,将核苷酸连续加至3’-OH末端,合成方向为5’→3’。
DNA聚合酶、RNA聚合酶•大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:5’→3’DNA聚合酶活性;5’→3’DNA外切酶活性;3’→5’DNA外切酶活性;RNA H酶活性•Klenow酶:不具备5’→3’DNA外切酶活性•T4噬菌体DNA聚合酶:不具备5’→3’DNA外切酶活性。
外切酶活性比Klenow酶强200倍,对单链DNA作用强于双链DNA•T7噬菌体DNA聚合酶:不具备5’→3’DNA外切酶活性•Taq DNA聚合酶•反转录酶:催化以RNA或DNA为模板,合成DNA;具有RNA H酶的活性•末端脱氧核苷酸转移酶:催化dNTP沿5’→3’聚合,逐个加于线性DNA分子的3’末端;不需要模板➢载体:(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子,可供插入或克隆目的基因或DNA,并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。
✦质粒载体:共价闭合环状DNA(cccDNA);开环DNA(ocDNA);线状DNA(lDNA)•质粒的三个重要性质:遗传传递的能力;遗传交换的能力;不相容性•用于克隆的质粒的三个要素:复制子、选择标记、多克隆位点•常用质粒载体:克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体✦λ噬菌体载体:插入型载体、置换载体•来源于噬菌体DNA,因可以插入较大DNA片段,常用于构建基因组文库和cDNA文库。
➢目的基因的常用制备方法✦化学合成法:前提:基因的DNA的序列已知。
小于100bp的片段:直接合成,最常用固相亚磷酸三酯法。
大片段目的基因:小片段粘接法、大片段酶促法✦PCR法:前提:已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
✦基因文库法:鸟枪法:适用于原核细菌目的基因的克隆分离✦cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;仅限于克隆蛋白质编码基因;mRNA含量少且t1/2短,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难第一链:mRNA模板,引物(polyT) ,逆转录酶,dNTPs第二链:自身引导法:取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH,煮沸;Klenow酶,dNTPs;S1内切酶)引导合成法:获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp;NaOH;退火;Klenow酶,dNTPs)♦基因文库的完备性:指在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:N= ln(1–P) /ln(1–f),P=完备性,f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小♦双酶切产生的粘性末端,最常用,可以确保连接方向的正确性♦影响连接效率的因素:连接方式;目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1;连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系➢重组DNA导入宿主细胞✦导入大肠杆菌:CaCl2法;转染法✦导入酵母:电转化法;化学转化法;原生质转化法✦导入链霉菌:原生质转化法;电穿孔法✦重组DNA导入哺乳动物细胞:显微注射法;DEAE葡聚糖转染法;DNA-磷酸钙转染法;阳性脂质体介导法;电穿孔法;细胞融合法;病毒感染法➢重组子的筛选与鉴定✦遗传标记筛选法:抗生素抗性筛选法;α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因,X-gal培养基,成功导入的菌落显示为蓝斑);营养缺陷型筛选法;噬菌斑筛选法✦核酸分子杂交法:菌落原位杂交法;DNA印迹法;RNA印迹法✦限制性内切酶图谱法:琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量,含有目的基因的为阳性克隆✦DNA序列测定法✦目的基因表达产物测定法原核细胞表达的特点及选择✦大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚;适合大规模生产(成本低,周期短,效率高,操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等✦缺点:缺乏翻译后修饰系统;容易以包涵体形式存在;外源蛋白容易被宿主酶系统水解★外源基因表达的调控原件:复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号✦用于原核表达的载体必须具备的条件:具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子,所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列)★外源基因在大肠杆菌中的表达方式✦胞内表达:非融合蛋白表达:蛋白质接近天然状态,易被降解,易形成包涵体。
有原核多肽基因融合蛋白表达:表达效率高;产物稳定;可以切除原核多肽,获得天然外源蛋白✦分泌表达:有信号肽基因,形成周质表达或细胞外表达★外源蛋白表达效率的影响因素✦外源基因密码子:大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子,外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子✦mRNA的结构:改变一级结构;降低5’端二级结构稳定性;调控3’端非翻译区二级结构✦表达载体的选择:表达方式;强的复制子(拷贝数高);强的启动子(转录效率高);高效率的核糖体结合位点;强的终止子(提高mRNA稳定性);适应范围广;稳定性高;产物易纯化。
✦外源蛋白的稳定性:采用融合蛋白形式表达;采用蛋白酶缺陷的突变菌株真核细胞表达的特点及选择➢常用的真核表达系统:酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较大肠杆菌巴斯德毕赤酵母载体原核载体穿梭载体调控序列原核原核和真核表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌翻译后修饰基本无有生产方式发酵,操作简单、经济发酵,操作较简单、较经济★酵母表达体系的影响因素✦外源基因的结构外源基因5’端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构,将阻止翻译进行富含A-T序列导致转录提前终止密码子的偏好性高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率✦表达形式及信号肽的选择:无信号肽常胞内表达;有信号肽,胞外分泌型表达✦启动子:多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子✦转化子的拷贝数:拷贝数越高,表达水平也越高✦诱导条件:甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择✦外源蛋白的降解:采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性,提高外源蛋白的稳定性。
➢哺乳动物细胞表达系统✦表达载体:病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等);质粒载体✦表达方式:瞬时表达、稳定表达、诱导表达➢基因重组蛋白的主要分离技术:离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取➢基因重组蛋白的主要纯化技术:离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱➢选择分离纯化方法的依据✦根据表达形式选择♦分泌型:沉淀和超滤♦周质表达:溶菌酶处理+渗透压休克♦胞内可溶表达:亲和层析或离子交换层析♦胞内不溶表达(包涵体):易与杂蛋白分开,但需要复性形成有活性的蛋白质。
✦根据分离单元之间的衔接选择♦先采用低分辨、分离规模大的方法,后采用高分辨的方法,最后采用分离规模小、速度慢的方法。
合理选择色谱分离次序✦根据分离纯化工艺的要求选择♦具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性;尽量较少组成工艺步骤;所用时间尽可能短;工艺和技术必须高效★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比,不同的方面✦Mr远大于小分子化学物质,致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。
如质谱✦基因工程药物结构复杂,常需多种检测方法✦两者杂质性质差别较大。
小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留;基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留,其检测一般都用专用的试剂盒。